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美法仑的0-羧甲基壳聚糖聚合物的制备，表征和体外效用

摘要：制备了具有不同间隔基的一系列美法仑-O-羧甲基壳聚糖（Mel-OCM-壳聚糖）聚合物并进行了结构表征。 所有的结合物均显示令人满意的水溶性（美法仑溶解度的160-217倍）。研究了化学和酶水解对体外药物释放度的影响。前药在木瓜蛋白酶和溶酶体酶内迅速释放美法仑约40-75％，而在缓冲液和血浆中仅释放约4-5％，这表明聚合物具有良好的血浆稳定性，并且木瓜蛋白酶和溶酶体中的水解主要通过酶解。 发现间隔物对Mel-OCM-壳聚糖聚合物的药物含量，水溶性，药物释放性和细胞毒性均具有重要影响。通过MTT测定的细胞毒性研究表明，与游离的美法仑相比，这些聚合物在体外对RPMI8226细胞具有52-70％的细胞毒性，表明聚合物没有丧失美法仑的抗癌活性。总的来说，这些研究表明Mel-OCM-壳聚糖聚合物是用于癌症治疗的潜在前体药物。

关键词：美法仑羧甲基壳聚糖聚合物前体药物

1.介绍

美法仑是一种细胞毒性药物，作为DNA的双功能烷化剂，自20世纪50年代后期引入临床治疗。 美法仑可以口服或全身给药来治疗多种癌症，包括骨髓瘤，卵巢癌和肉瘤等。美法仑在临床应用中的主要障碍是由于其极差的水溶性，相对不稳定性，快速的血浆清除率，较差的生物利用度和生物相容性（David, Roger, amp; Valentino, 1999），这会造成严重的副作用。

为了解决这些问题，已经进行了许多合成美法仑衍生物的努力。美法仑的化学结构引入N-末端和C-末端的修饰以及掺入肽（Morris, Atassi, Guilbaud, amp; Cordi, 1997; Peyrodeet al., 2012; Sartania et al., 1999; Scutaru, Wenzel, amp; Gust, 2011; Zhao, Meng, Yuan, amp; Lan, 2010）。例如，beta;-丙氨酰-Mel（Mittal et al., 2004）和美法仑的脯氨酸前体药物（Mittal et al., 2004)已经制备出来。 这些化合物显示出很高的细胞毒性并且具有提高肿瘤选择性的潜力。 尽管如此，这些前体药物仍不溶于水，并且不可避免地迅速从体循环中清除出去。

用生物相容的水溶性聚合物共轭药物分子是解决这些问题的另一种方法。 聚合前药具有几个优点，包括：（1）增加低溶性或不溶性药物的水溶性，并因此提高药物生物利用度； （2）防止药物在流通过程中失活并保持其活性；（3）药代动力学的改善； （4）由于增强的渗透性和保留（EPR）效应而提供被动靶向的能力（Khandare amp; Minko, 2006; Mahato, Tai, amp; Cheng,2011），已经合成了包含烷化剂的许多聚合物前药，包括聚氨基酸（聚-L-赖氨酸和聚-L-谷氨酸）-Mel（Yasunori et al., 1984）， HPMA共聚物-Mel（Duncan et al., 1991)），白蛋白 - 苯丁酸氮芥（Kratzet al., 1998），转铁蛋白 - 苯丁酸氮芥,PAMAM-chlorambucil（Bielawski， Bielawska， Muszyn#39;ska， Poplawska， amp; Czarnomysy， 2011) 和尿脱氧葡萄糖 - 苯丁酸氮芥（Miot- Noirault et al., 2011)。这些研究证明，掺入用于将药物附着到载体上的共价键的这种聚合物适合于烷化剂递送。

合适的聚合物载体必须是具备生物相容性和水溶性的。 OCM-壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，由于其具备无毒性和生物降解性，是药物载体最有用的候选物之一（Fu et al., 2011)。此外，OCM-壳聚糖可以很容易地从几丁质衍生而来，具备天然、便宜且丰富的优势。 OCM-壳聚糖在分子中含有大量的COOH和NH₂基团，可以通过直接连接或通过接头容易地与药物和蛋白质聚合。 壳聚糖衍生物基于前体药物已经获得了重要的药物递送性质。 增加循环中治疗剂的寿命，并通过肿瘤中的被动积聚将抗肿瘤药物引导至肿瘤组织。

在聚合物前体药物设计中，聚合物的连接在确定治疗潜力方面起着至关重要的作用。 氨基和小肽接头被广泛使用（Greenwald, 2001; Mitsunori, Hiroyuki， Toshiro, Takehiko, amp; Satoshi, 2000) 由于它们的共价偶联和生物降解性的化学多功能性，它们可以作为纤溶酶和蛋白酶的特异性底物，其浓度在各种肿瘤治疗中提高很多。

在这项工作中，为了改善不同氨基酸间隔基因（包括1-甘氨酸（Gly），1-苯丙氨酸（Phe），1-苯基丙氨酸（Phe），1-苯基丙氨酸（Phe））的美法仑，Mel-OCM-壳聚糖聚合物的水溶性，体循环时间和药代动力学特性。 系统研究了Mel-OCM-壳聚糖聚合物的溶解性，体外药物释放，细胞毒性。据预计，聚合物在循环期间将是可溶的和稳定的，而在靶细胞中，聚合物可使美法仑受控释放。

2.实验

2.1物料

OCM-壳聚糖（分子量8.6times;104，脱乙酰度91％，取代度85％）购自青岛迅博生物技术有限公司（中国）。 美法仑购自苏州立德化学有限公司（中国）。 氨基酸购自阿拉丁试剂有限公司（中国）。 从国药集团化学试剂有限公司（中国上海）获得1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC HCl），1,3-二环己基碳化二亚胺（DCC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）购自Sigma-Aldrich Chemical Co.，Ltd。（St.Louis，MO）。 成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200-225g）来自湖北省实验动物中心（武汉，中国）。 所有其他试剂均为分析级，并且无需进一步纯化即可使用。 从ATCC（USA）购买RPMI8226细胞，并在含有12％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，100mu;g/ mL青霉素和100mu;g/ mL链霉素的RPMI 1640培养基中生长。

2.2.Mel-OCM-壳聚糖聚合物的合成

2.2.1.Fmoc-Mel的合成

Fmoc-Mel的合成参考了先前的文献（Zhao et al., 2010).将在二恶烷（20mL）中的9-芴基甲基N-琥珀酰亚胺基碳酸酯（Fmoc-Osu，3.71g，11mmol）加入到美法仑（3.21g，10mmol）在二恶烷（50mL） ，蒸馏水（15mL）和NaHCO₃（0.93g，11mmol）。 将混合物在0℃）搅拌2小时，然后在室温下搅拌20小时。将反应混合物浓缩并在乙酸乙酯和蒸馏水之间分配。用盐酸将该混合物调节至pH=2，然后用乙酸乙酯（3times;50mL）萃取水相。将合并的有机相用蒸馏水和盐水洗涤并用MgSO4₄干燥。通过柱色谱法（己烷：乙酸乙酯= 3：1，v / v）纯化固体残余物，得到呈白色粉末状的固体化合物。

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2.2.2.Fmoc-Mel-氨基酸的合成

在0℃下用DCC（1.05当量，10.5当量）处理Fmoc-美法仑（10mmol，5.43g）和NHS（1.05当量，10.5mmol，1.21g）的无水THF（100mL） mmol，2.17g）。 2小时后，使混合物升温至室温并搅拌22小时。 通过滴加除去沉淀，并用无水THF（2times;10毫升）。 合并洗涤液和含有Fmoc-苯丙氨酸酐的催化剂。 将氨基酸（10mmol，包括Gly，Phe，Leu和Pro的氨基酸）缓慢加入到NaHCO₃（1当量，10mmol，0.84g），水（50mL）和THF 30毫升）。 搅拌15分钟后，将上述制备的Fmoc-苯丙氨酸酐的THF溶液加入到该悬浮液中。 将混合物在室温下搅拌22小时，然后在30℃真空中尽可能除去THF，然后将混合物在乙酸乙酯和水之间分配并用盐酸将pH调节至2，用乙酸乙酯（3times;15mL）萃取。 将合并的有机相用蒸馏水和盐水洗涤并用MgSO₄干燥。 将所得溶液浓缩并通过柱色谱（己烷：乙酸乙酯= 1：1，v / v）纯化，得到灰白色固体化合物。

2.2.3.Mel-OCM-壳聚糖聚合物的合成

将Fmoc-Mel-氨基酸（2mmol）与EDC（383mg，2mmol）在20mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中混合并在室温下反应4小时。 然后，将NHS（230mg，2mmol）加入到上述混合物中，并将全部混合物在室温下搅拌6小时以获得NHS活化的Fmoc-Mel-氨基酸。 将OCM-壳聚糖溶解于10mL蒸馏水中，并在30分钟内将NHS活化的Fmoc-美法仑氨基逐滴添加至OCM-壳聚糖溶液中。 使混合物在室温下反应48小时，并将溶液的水在50◦C下真空除去，同时加入适量的甲苯数次。 然后用哌啶将美法仑的N-Fmoc衍生物脱保护。

最后，产物用DMF和去离子水彻底透析（MWCO 14,000），然后冷冻干燥以获得白色棉花状产品。 用相同的方法合成不含氨基酸间隔物的Mel-OCM-壳聚糖聚合物。 产品合成并命名为表格1。

表格1

具有不同接头和Mel含量的Mel-OCM-壳聚糖聚合物的合成。

2.3.仪器分析

在Varian 600光谱仪（Varian，USA）上使用四甲基硅烷作为内标在25◦C下测定。Fmoc-Mel，Fmoc-Mel-Gly，Fmoc-Mel-Phe，Fmoc-Mel-Leu和将Fmoc-Mel-Pro溶解在CDCl₃中，而将OCM-壳聚糖和Mel-OCM-壳聚糖聚合物溶解在D₂O中。

2.4.Mel-OCM-壳聚糖聚合物的药物含量

掺入的美法仑的含量通过测量聚合物溶液在261nm的蒸馏水中的UV吸收来测定。美法仑含量的测定是借助美法仑在混合溶液（甲醇：水：乙酸= 49.5：49.5：1）中范围为2-50mu;g/ ml，R²=0.99636的校正曲线来确定的。

2.5.Mel-OCM-壳聚糖聚合物的溶解度

为了评估聚合物和美法仑的溶解度，将20mg Mel-OCM-壳聚糖聚合物或美法仑分别加入到1mL去离子水中，将混合物涡旋5分钟，超声处理5分钟，并以6000rpm离心5分钟。 收集上清液并使用UV分光光度计分析。 通过在261nm波长处测量UV吸收量来量化美法仑的量。

2.6.Mel-OCM-壳聚糖聚合物的体外药物释放

聚合物的化学水解一式三份地在pH 7.4和5.8的37℃磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行。 将聚合物溶于PBS并轻微搅拌。 在预定的时间，取出20mu;L溶液并用冰冷却的甲醇（380mu;L，含有2％乙酸）稀释。 将混合物涡旋5分钟，超声处理1分钟，并以6000rpm离心5分钟。 注射20mu;L上清液并通过HPLC方法分析以确定来自聚合物的美法仑的释放。

除了预处理过程之外，用于分析血浆和酶溶液中的美法仑释放的方法与PBS中的水解类似。 从成年雄性Sprague-Dawley大鼠获得大鼠血液和肝脏。 每毫升血液中加入大约4IU肝素以防止凝血。血液立即在6000rpm，4◦C下离心5分钟以收集淡黄色上清液作为血浆。 根据以下方法通过对肝匀浆溶液进行差速离心来制备大鼠肝溶酶体酶（三体）。木瓜蛋白酶和三糖体溶液在使用前需要用1mm乙二胺四乙酸（EDTA）和5mm谷胱甘肽在37℃下还原15分钟。 在所有情况下,使用的美法仑浓度均为1mg / mL。

2.7.体外细胞毒性

通过MTT法评价聚合物的细胞毒性。 将RPMI8226细胞以5x104细胞/孔的密度接种于96孔微量滴定板中RPMI 1640培养基中并温育24小时。 将美法仑或Mel-OCM-壳聚糖聚合物（相应的20-100mu;g/ ml的美法仑浓缩物）加入到培养基中。 温育48小时后，向每个孔中加入10mu;LMTT（5mg / mL）的PBS溶液（pH7.4），并进一步在5％CO₂培养箱中于37℃温育4小时。 除去含有MTT的培养基后，加入100mu;LDMSO以溶解在活细胞中形成的甲瓒结晶。 最后，使用酶标仪（BIO-RAD，Model 550，USA）在570nm处测量吸光度。 通过（OD_控制OD_控制）/ OD_控制100计算相对细胞抑制率（％）。数据全部用空白组进行对照，空白组为不存在RPMI8226细胞的培养基。

3.结果与讨论

3.1.中间体和前药的合成和结构分析

在此研究中，我们使用不同的氨基酸作为间隔物来合成一系列Mel-OCM-壳聚糖聚合物和合成Mel-OCM-壳聚糖的路线如图所示图1。美法仑的NH₂首先用Fmoc-Osu保护。 然后，通过碳化二亚胺化学活化COOH并与不同氨基酸接头的NH₂化学偶联。 在以下步骤中，在EDC HCl和NHS的催化下，将Fmoc-Mel和Fmoc-Mel-氨基酸接枝到OCM-壳聚糖的NH_{2 全文共8848字，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料}

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