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具有调控细胞生长功能的软骨组织工程多层支架材料

摘要：关节软骨在滑膜关节中起重要作用，能减少相邻两骨的摩擦，缓冲运动时产生的震动，对哺乳动物的骨骼活动至关重要。由于其具有细胞密度低和无血管的性质，且其组织再生能力有限，因此受伤、磨损、裂缝或疾病导致的软骨受损通常需要手术干预。虽然关节软骨已被预测是首批可成功工程化的组织之一，但实践证明要仿制这一天然组织的复杂结构和生物力学性能是一种挑战性的工作。本文中，我们介绍了一种多层高分子纳米复合材料支架，它能够模拟成熟关节软骨的结构设计、力学特性及所包含的化学成分，并且能够以一种空间控制的方式引导培养的软骨细胞完成细胞形态、取向和表型状态的转变。这种支架具有类似天然仿生的特点而能够支持组织的生长，并且促进局部羟基磷灰石的形成，从而使其与软骨下骨结合形成一体。

关键词：软骨；支架；组织工程；多层；纳米复合材料

1.引言

由于关节软骨由单一类型的细胞（软骨细胞）组成，并且无血管组织，因此成人的关节软骨通常是组织工程直接明确的目标。然而，成熟软骨由三个不同的层和区域组成，各有不同的细胞外基质（ECM）的成分、细胞表型以及组分的取向。这种结构复杂性是成熟软骨的各向异性、非线性粘弹性的机械性能的起源，并且很大程度上由胶原纤维的区域依赖取向性和渗透压所主导——粘多糖相互作用导致滑液的滞留，进而产生渗透压。

由于关节的生物力学环境严苛——同时承受大的剪切力和压力，以及高应变——成功的组织修复要求生物力学健康的软骨的使用能够再生。看起来体外生长在支架内的新生软骨结构更能满足这种要求，因为比起缺少支架的工程软骨替代物，在体外环境中人工支架在一开始能够提供适当的机械支撑。大体上，支架其特别的结构，机械特性和化学环境也能促进细胞粘附、增殖及分化，因此能够引导组织成型并与周围天然组织（包括软骨下骨）形成一体。

在关节软骨细胞的体外培养中，由于缺少某些化学物质，有很多情况会导致细胞分化和纤维软骨的形成。研究表明，基于天然水凝胶的支架或各种合成高分子水凝胶能够支持软骨组织的生长，使其呈现球形软骨细胞形态和表型特征，但是水凝胶结构简单，导致其力学性能不及成熟透明软骨。最近研究表明多层支架能够模仿骨-软骨的界面，并且有一个骨整合层和一个各向同性的软骨层，由于密度梯度或不同孔隙率和孔径的多孔层的结合，多层支架还能够模仿关节软骨不同层的力学性能。虽然最近有研究提出，更复杂的支架有助于与成熟软骨相似的组织结构的再生，这种支架可以高度模仿软骨组织成分的多层结构和排列，例如胶原蛋白和关节软骨细胞，以及与相关的细胞分化过程密不可分的化学物质，但是这种结构尚未实现。

图1. 成熟关节软骨的结构和多层聚合物纳米复合材料支架。简化示意图呈现了天然软骨（左）的多层结构，其细胞形态学和表型状态，细胞外基质组分如胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG）的种类以及这些成分中的部分取向特性与位置密不可分。多孔多层支架（右）能够模仿这种天然结构，包括与软骨下骨平行取向的含管状孔的各向异性PLA表面层，基于PLA和硫酸化CNCs的各向同性中间层，以及垂直于软骨下骨、孔呈管状且含有PLA和磷酸化CNCs的各向异性的深层。

我们在文中报道了一种多层聚合物纳米复合支架，能够模仿成熟关节软骨（图1）的细胞外基质成分和特有的胶原蛋白的排列取向。这种新的支架由三层组成，分别对应天然软骨组织的表层、中间层、深层，能够以空间可控的方式引导培养的软骨细胞的完成形态表达、取向和表型状态，促进与软骨下骨的整合，并提供足够的机械支持。

2.材料与实验方案

2.1.磷酸化和硫酸化钠米纤维素的提取

按照文献中的方法用硫酸或磷酸水解1号沃特曼滤纸。然后用透射电子显微镜(支持信息 Fig. S2)和电导滴定法(支持信息Fig.S1)对钠米纤维素进行表征。 对硫酸化和磷酸化的CNCs分别测定8.7plusmn;2.8和8.6plusmn;2.1的长宽比。S-CNC和P-CNC的电荷密度分别为98.5plusmn;8.2和10.1plusmn;1.6mM/kg。

2.2.若丹明官能化钠米纤维素

对Araki等人最初描述的方案稍作修改后，用盐酸水解1号Whatman滤纸。按照4％wt/wt的浓度比，将这些不带电荷的纳米晶体在干燥的二甲基甲酰胺中超声处理4小时。将0.05当量若丹明B异硫氰酸酯（Sigma-Aldrich）和一滴二月桂酸二丁基锡（Sigma-Aldrich）加入到分散体中，然后在100℃和N2气氛下搅拌过夜。用乙醇5000转/分钟离心10分钟清洗分散液，倾析上清液并加入新鲜的乙醇，重复5次。然后在黑暗中用水透析法将CNCs透析五天并冷冻干燥。通过紫外/可见吸收光谱用波长为555nm的光对官能化情况进行量化，然后在完成标准加入步骤后进行基线扣除。附着的若丹明的量经测定为9.6plusmn;0.3mmol/kg纤维素（支持信息图S5）。并且通过透射电子显微镜表征若丹明-CNC的尺寸，确定长宽比为8.6plusmn;2（支持信息图S6）。

2.3.支架的制备

聚（D，L-丙交酯）（D:L=89:11）购自Nature-Works（4060D）并按原样使用。通过标准凝胶渗透色谱（GPC）实验计算分子量（M_w）为1.143times;10⁵，聚合度分散性（M_w/M_n）为1.66。根据文献的描述[27,28]，通过热诱导相分离法（TIPS）制备支架。各向同性支架由固-液TIPS法制备，通过50mg/mL聚合物溶液，在1,4-二恶烷：水混合物（87:13，体积％）中。将7.5g聚合物在室温下先溶于130.5mL1,4-二恶烷中，剧烈搅拌并放置过夜，随后加入19.5mL水（非溶剂）以达到50mg/L的最终聚合物浓度。随后，加入S-CNCs达到10％wt/vol浓度，并在超声波浴（Sonoswiss SW3H，Sonoswiss AG，​​Ramsen，瑞士）中超声处理2小时，用连续的水流以避免样品升温。然后将溶液加热1小时至60℃以克服混合物的浊点，在聚合物/1,4-二恶烷溶液中产生水乳液，然后将其转移至塑料烧杯中并在液氮中冷冻。1小时后，为确保完全冷冻，获得直径约9cm和高度3-4cm（取决于初始体积）的聚合物/溶剂混合物块，并将其转移到玻璃冻干罐中，然后立即浸入含有乙二醇的 10℃冷却浴中（Julabo F25，Julabo GmBH，Seelbach，Germany）。然后将烧瓶连接到在10^-2 torr下操作的真空线上，并将升华物收集在捕集器中，捕集器每天倒空两次，直到样品完全干燥（3天，4天，取决于起始体积）。通过液-液TIPS方法以类似的方式制备各向异性支架。 通过将3.75g聚合物与150mL碳酸二甲酯混合，在室温下搅拌4h，制备浓度为25mg/mL的聚合物溶液。当需要时，将P-CNC加入到溶液中并如上所述进行超声处理以达到10％wt/vol浓度。然后将分散体转移到浸在液氮中1小时的塑料烧杯中。将冷冻块转移到玻璃冻干罐中，然后将其浸入10℃的乙二醇冷却浴中，并如上所述在10 -2托下真空干燥。用直径为8mm的一次性活检穿孔器（Robbins Innments公司，新泽西州，美国）冲压干燥的支架层。

通过用丙酮（聚合物的挥发性溶剂）浸渍的无尘薄纸轻轻地润湿其中一层的表面，并使其与第二层接触来制备多层支架。重复相同的过程来附加第三层。

2.4. 羟基磷灰石的生长

单层支架分别由整齐的各向同性和各向异性PLA，PLA / P-CNC（各向异性）和PLA/S-CNC（各向同性）组成，用一次性活检穿孔器和一把剃刀刀片将其切成直径8mm和高3-4mm（用游标卡尺测量）的圆柱形。将样品制备三份并置于50mL灭菌离心管中，无菌离心管装有超纯水（=18.2mcm）溶解的饱和CaCl₂溶液（100mM）。在整个过程中，样品保存在37℃的烘箱中。当超纯水冲洗后，将样品转移到新的50mL离心管中，溶液每天更换一次，持续3天。然后将样品浸于1.5x模拟体液（11.994gNaCl，0.525gNaHCO₃，0.336gKCl，0.261gK₂HPO₄，0.458gMgCl₂·6H₂O，60mLHCl（1M），0.417g CaCl₂，0.107g Na₂SO₄，9.086 g Tris（CH₂OH）₃CNH₂，总体积为1L超纯水，pH7.4）。将样品转移到培养皿中并在50℃烘箱中干燥过夜，每天更换一次溶液，持续7天。

2.5 扫描电子显微镜（SEM）和X射线散射能谱（EDX）测试

对于形态学和组成研究，将支架纵向切割并分析内表面。用导电双面胶将样品固定在金属样品台上。多孔样品的周边用银导电涂料涂覆以确保从样品表面到样品台（Auromalreg;）的导电性。在室温下干燥至少1小时后，将样品在高真空度（10-6atm）下放置过夜，然后用金（形态学测试）或碳（组成测试）层涂覆。 在Baltec CED 030（Leica microsystems GmbH，VD，瑞士）上进行碳（20-30nm）的溅射。在Baltec MED 020（Leica microsystems GmbH，VD，Switzerland）中进行金溅射。在石英晶体微天平上测得涂层的厚度为25nm。

用装有二次电子探测器和透镜探测器（TLD）的SEM FEI XL30 Sirion FEG和装备阴极发光尖端的Centauros闪烁器型背散射电子探测器分析样品。能量色散X射线光谱仪系统（EDAX Inc.，NJ，USA）配备有锂掺杂硅检测器。在10KeV电压下记录二次电子显微照片，光斑尺寸为4-5，工作距离为10-20mm。在5 KeV电压下记录背散射电子显微图，光斑尺寸为4，工作距离为5-10 mm。在25KeV的电压，尺寸为4的点和小于5mm的工作距离下记录EDS谱。使用EDAX Genesis软件5.2版进行光谱分析，并进行光谱分析，在自动背景扣除后，鉴定元素峰并自动确定元素之间的比例。

2.6 力学性能测试

压缩试验在装有200N和10kN载荷传感器的Zwick / Roell Z010拉伸试验机上进行，分别进行平衡和非平衡试验。在37℃下，在PBS中进行实验，并在BioBath Environmental Chamber T 200（TestResources）上连续流动。分别预载5和25kPa于各向异性和各向同性样品。在所有实验中以0.04mm/min的应变速率进行压缩测试。平衡蠕变试验通过施加16步骤的负载来实现的，控制应变每间隔600s的弛豫时间增加5％。控制1.5％的应变速率，两步之间有600s的松弛时间（支持信息见图S7-S11），绘制10步的曲线，从而计算得到杨氏模量和弹性模量。然后从放松后的负荷值提取数据，并进行曲线拟合，计算斜率。数据取5个样本的平均值，以平均值plusmn;标准偏差表示。

2.7 纳米复合膜的形成

将PLA溶解于二甲基甲酰胺中，配成浓度为40mg/mL的溶液，在70℃下搅拌4小时。向聚合物溶液中加入10％wt/vol的CNCs，并在连续水流浴中超声处理4小时，以避免样品被加热（Sonoswiss SW3H，Sonoswiss AG，Ramsen，Switzerland）。然后将分散体溶液浇铸到聚（四氟乙烯）培养皿上，并在70℃下干燥3天，得到2g干燥纳米复合膜。然后将这些膜在垫片间140℃下压塑5分钟以获得均匀厚度，卡尺测量厚度在150-200mm之间。通过用不锈钢冲孔机冲压薄膜制备直径为1.2cm的纳米复合材料薄膜以进行细胞培养实验。

2.8 软骨细胞培养

以10.000-12.000 cell/cm²的密度在完全培养基（软骨细胞生长培养基，Cell Application Inc.，San Diego，CA，USA）中培养第二代人胎儿软骨细胞（原代细胞）（Cell Application Inc.San Diego，CA，USA），保持培养基体积与表面积之比为0.4mL/cm²。每天更换培养基，直到60％的细胞完成汇合，然后培养基的体积增加一倍。在80％的细胞汇合时，用HBSS（Gibco，生命技术）漂洗细胞两次，然后胰蛋白酶消化4分钟进行传代培养。将细胞重悬于10mL HBSS中，设置转速为1.6x10³rpm进行离心沉淀，并重悬于5mL扩增培养基中。在Neubauer室中计数细胞。

2.9 在无孔膜上培养软骨细胞

如上所述制备纯PLA薄膜和PLA/S-CNC和PLA/P-CNC纳米复合薄膜，并切成1.2cm直径的半圆（注意细胞附着到薄膜的两侧），在70％EtOH中清洁15分钟并直接放入24孔板（每个样品重复放6个孔）。将膜用扩展培养基冲洗3次以除去任何残留的乙醇。将足够的细胞悬液等分试样加入膜的顶部以达到10,000-12,000个细胞/cm²的密度。在4孔显微镜培养载玻片（BD Biosience）上直接培养阴性对照组以比较细胞形态和活力。培养48小时后，将聚合物膜转移至新的24孔板（以避免底部附着的细胞的干扰）。在扩展培养基中培养7天后，对照组中的细胞达到80％汇合。

2.10 乳酸脱氢酶（LDH）释放和二辛可宁酸（BCA）测定

如上所述培养细胞，并在细胞达到80％汇合前一天，向培养基中加入100mL 0.2％Triton X-100作为阳性对照；还有6个孔填充了中间物（作为背景且颜色随时间变化）。汇合时（7天），收集所有不同聚合物样品以及阳性和阴性对照的培养基，如在显微镜培养载玻片上生长的细胞。根据

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