壳聚糖/聚乳酸-羟基乙醇酸包覆羟基磷灰石纳米颗粒及其抗菌性、骨传导和骨组织再生能力的效果研究外文翻译资料

 2022-06-16 09:06

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壳聚糖/聚乳酸-羟基乙醇酸包覆羟基磷灰石纳米颗粒及其抗菌性、骨传导和骨组织再生能力的效果研究

尚颖皓

摘要:一直以来,与纳米羟基磷灰石结合的生物复合材料在天然骨组织再生、填充和增强方面有很大的前景。而壳聚糖作为天然聚合物衍生物拥有许多理化性质,这些性质使它在骨组织工程领域备受关注,同时,聚乳酸-羟基乙醇酸更是一种早期发现的用于药物缓释和组织工程的合成高分子聚合物,然而,壳聚糖能够破坏细胞膜的完整性,可能会导致血栓的形成。聚乳酸-羟基乙醇酸释放酸性副产物,可能引起组织炎症,影响干扰愈合过程。提高壳聚糖和聚乳酸-羟基乙醇酸的生物相容性的一种方法是将两者结合达到互补的目的。本次研究中我们提供了合成与表征方法,研究了体内体外环境中壳聚糖和壳聚糖/聚乳酸-羟基乙醇酸两种体系包覆的羟基磷灰石纳米颗粒的特性。其中,合成和加工的方法是溶剂/非溶剂沉淀法冷冻干燥,并利用热分析质谱法在包覆过程中进行了相分析。实验结果显示,壳聚糖/羟基磷灰石复合颗粒对四种试验用的微生物菌株表现出最高的抗菌性能,但在骨缺损重建之后,它们在缺陷处新形成的组织中也会引起炎症反应。聚乳酸-羟基乙醇酸包覆羟基磷灰石纳米颗粒不仅能减少复合微粒的反应性和抗菌活性,而且有利于在骨损伤区域获得更好的新生骨组织。

关键词:抗菌活性,骨再生,壳聚糖,羟基磷灰石,聚乳酸-羟基乙醇酸,热分析质谱法

1.前言

大量研究表明,合成纳米羟基磷灰石不仅在骨组织工程上是热门材料,在吸附剂、传感器、光学成像及控制药物传递等众多领域都有一定用途。改善羟基磷灰石的性能一般有两种途径:(1)微结构的控制;(2)与其他元素和材料进行结合。显然,通过这些方法改进的空间很大。对于控制微观形貌,众所周知,诸如形态、结晶度、晶粒和粒径、形貌、孔隙度和组分比例等对羟基磷灰石的理化性能都有极大的影响;对于羟基磷灰石的掺杂,它的三种组成离子钙、磷、羟基均可被其他离子取代,现在已经存在很多种不同化学组成的羟基磷灰石。本实验室利用水热合成法合成了用钴取代钙离子的纳米羟基磷灰石,并且在体内实验中,所制得的材料具有良好的生物学性能。其他离子替换,除了罕见的掺杂剂,例如钾,钠,硒,镧系元素和放射性核素外,包括镁,锌,硅,锶,铁,钴和碳酸盐等,在文献中均有被提到。

纳米技术的进步使得以羟基磷灰石为核心的混合多组分体系的设计成为可能。由此技术得到利用聚乳酸-羟基乙醇酸的合成高聚物包覆羟基磷灰石材料,并且材料非常适合填充骨缺损。具有生物兼容性的聚合物包覆羟基磷灰石为携带固定活性制剂包括维生素和抗生素的多功能纳米颗粒机制提供了可能性。这种软、聚合物和硬矿物成分的组合也被认为是制造模仿骨骼自然特性的材料的途径。

壳聚糖是一种生物衍生多糖,它主要来自甲壳类、珊瑚类或水母类。由于它的生物相容性和一系列有趣的特性,包括抗菌、抗肿瘤,抗炎免疫增强剂,壳聚糖在生物医学上有多功能的用途。然而,壳聚糖的阳离子性会破坏细胞膜的完整性,促进细胞毒性,也会引起血栓的形成,这些也是壳聚糖不能广泛使用的原因。增加壳聚糖的血液相容性可以通过不同的方法,主要是对其进行化学改性或混合具有互补特征的其它化合物。羟基磷灰石颗粒结合壳聚糖和生物衍生聚合物的复合由于具有敏感的生物感应,在骨组织工程领域引起广泛关注。这类复合材料植入体内后能诱导骨形成,并显示出血管重建缺损的成功,以羟基磷灰石和壳聚糖为基质的骨髓间充质干细胞注射系统也促进了异位性骨在体内的形成。三维羟基磷灰石和壳聚糖复合支架也是骨组织再生医学中干细胞的良好基质。此外,大孔的3-D羟基磷灰石壳聚糖支架的互连网络形式的聚合物基质被用来修复受损或病变的骨头。

壳聚糖能够破坏细胞膜的完整性,不适合作为血液接触的生物材料,而在骨组织工程中最常用的合成聚合物聚乳酸-羟基乙醇酸会释放酸性副产物,可能会引起组织炎症,阻碍愈合过程。提高壳聚糖和聚乳酸-羟基乙醇酸的生物相容性的一种方法就是将两者结合起来,得到互补的效果。本次课题研究的是未经包覆和经壳聚糖和聚乳酸-羟基乙醇酸包覆的纳米羟基磷灰石颗粒,在包覆过程中,热分析质谱法被用来进行相鉴别。得到的可控大小的球形颗粒粉末被用做填充物来进行人工骨缺损的体内重建。在此之前,我们分析了它们与体外培养的成骨细胞的相互作用,以及对四种微生物菌株:金黄色葡萄球菌、表皮瘤菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌的抗菌特性,合成材料的抗菌能力与体内骨形成性能评估有关。

2.材料和方法

2.1材料的合成

在温度50℃时,将硝酸钙水溶液(150ml;26.6wt%)加到(NH4)3PO4(7 ml H3PO4 165 ml NH4OH 228 ml H2O) 以100 r/min的搅拌速度搅拌60min。然后溶液在100℃温度下进行热处理60min,获得的冷凝胶在-10℃到-60℃,压力0.037KPa到0.01KPa下处理1到4个小时,最后得到的产物为纯的羟基磷灰石粉末。

溶解在乙酸(1wt%)中的低分子量壳聚糖(奥德里奇,脱乙酰度gt;75 %)与羟基磷灰石凝胶以4 :6的质量比混合,并用磁力搅拌器以400r/min的转速搅拌均匀。然后,在21000r/min的转速(Ultra-Turrax T25, IKA,德国)下,不断将蒸馏水加入到壳聚糖和羟基磷灰石凝胶混合物中,得到的壳聚糖和羟基磷灰石的混合物倒入戊二醛(I级,25%H2O),并在21000r/min的转速下搅拌1h,继续将混合物在5000r/min和5℃下离心1h(德国仪器,通用型320R),离心后的混合物用蒸馏水洗涤两次,在干燥箱中,条件为20℃和0.1MPa下干燥12h,干燥后的粉末在温度-10℃到-60℃,压力0.037KPa到0.01KPa下处理1到6h就可以制得壳聚糖/羟基磷灰石颗粒的复合产物。

将聚乳酸-羟基乙醇酸(50:50,Sigma,美国)分别溶解在丙酮和乙酸中,然后与羟基磷灰石凝胶以2:2:6的质量比进行混合。将伯格沙姆188(聚醚多元醇,体积分数0.1%)的水溶液逐滴加入到壳聚糖、PLGA和羟基磷灰石的混合物中,并在在21000r/min的转速进行搅拌,获得的混合物倒入戊二醛(I级,25%H2O),并在21000r/min的转速下搅拌1h,继续将混合物在5000r/min和5℃下离心1h,离心后的混合物用蒸馏水洗涤两次,在干燥箱中,条件为20℃和0.1MPa下干燥12h,干燥后的粉末在温度-10℃到-60℃,压力0.037KPa到0.01KPa下处理1到8h就可以制得壳聚糖/聚乳酸-羟基乙醇酸包覆羟基磷灰石纳米颗粒粉末。

2.2材料的表征

XRD分析仪器为飞利浦PW-1050,NI过滤,CUKalpha;辐射。场扫描SEM分析仪器为MIRA 3 MXU (高分辨电镜, Tescan) 。傅里叶红外光谱采用KBr技术,仪器为BOMEM MB-100光谱(哈特曼amp;布劳恩,加拿大),光谱范围在400到4000cm-1。光谱分辨率为2cm-1。同步热分析采用热重分析、差热分析 SETSYS 2400 CS系统(塞塔拉姆仪器)携带气体分析质谱系统 (Omni Star GSD 320,菲弗)。以10℃/min加热使空气从28℃到600℃,并让10plusmn;0.5mg的样品通过这些空气流。粒径分布(PSD)是以10mg/ml将粉末分散到水中并使用Mastersizer 2000(马尔文仪器有限公司)和带有液体分散剂的水分散装置来测量。

2.3抗菌活性实验(微量稀释法)

本次实验采用微量稀释法,参考实验室大肠杆菌菌株(ATCC的评价8739)、铜绿假单胞菌(ATCC 9027),金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)和白色念珠菌(ATCC 10231)对羟基磷灰石、壳聚糖/羟基磷灰石复合物和壳聚糖/PLGA/羟基磷灰石复合物进行了体外抗菌活性实验。在测试之前,对粉末样品进行紫外消毒,避免微生物杂质的影响。我们也利用培养基和无菌生理盐水(0.9%NaCl)准备了微生物菌株,它们的光学密度标准化为0.5 M McFarland,相当于107–108CFU/mL。样品溶液是在无菌磷酸盐的缓冲液中制备。连续双稀释测试范围是31.2–0.015 mg/ml,9.2–0.004 mg/ml和12.8–0.006 mg/ml,测试需要在96孔微量滴定板接种细菌培养的Mueller Hinton液(pH 7.3)和酵母培养的Sabouraud dextrose液(pH 5.6)(研究所免疫学和病毒学,Torlak,贝尔格莱德),每一个孔里最后的体积是100ul,最后的浓度是106CFU/mL,然后在37℃的温度下培养24h。所有的实验都进行了三次,其中两个生长控制包括:氢钾相应的介质磷酸盐缓冲液作为阴性对照和抗生素四环素制霉菌素(APPL.Chen)作为阳性对照。细菌的生长测定通过添加20ul的0.5%的TTC水溶液来表征,利用方差分析来确定所获得的数据的统计意义(Ple;0.05)。

2.4 体外实验设计

2.4.1 细胞培养

小鼠颅骨成骨细胞的获得是参照ATCC和DMEM培养基,DMEM培养基是经过Dulbecco改良的,含有10%的胎牛血清,5%的抗生素/抗真菌和100uug/ml的抗坏血酸,可以诱导细胞从成纤维细胞到成骨细胞的分化。

2.4.2 免疫组织化学

小鼠颅骨成骨细胞接种在盖玻片上的密度为5times;105细胞/孔的24孔板中,孔中含有3mg的纳米粉末。细胞在含有纳米粉末的分化培养基中培养7天,在第七天,用PBS冲洗细胞,除去多余的颗粒并用4%的多聚甲醛固定5min,然后每个细胞都用PBS冲洗5min。固定的细胞在含有0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚和1%牛血清白蛋白的培养基中培养1h,在结块后,在室温下用Alexa Fluor 568(1:400)对细胞进行染色标记1h。完成后,盖玻片1x PBS冲洗5min,用NucBlue固定细胞成像剂对细胞核染色20min,再利用Zeiss LSM 710显微镜成像。

2.5 体内移植和组织分析

实验中利用20只小鼠进行了骨增生试验,它们被分为两组,一组为空白对照组,有五只小鼠,其余为试验组,有15只小鼠,试验组进一步被分为三个小组,每组有5只小鼠。试验组第一组小鼠将羟基磷灰石粉末植入骨缺损处,第二组小鼠将羟基磷灰石粉/壳聚糖粉末植入骨缺损处,第三组将羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸植入骨缺损处。

试验组动物在下颌牙槽骨左侧,在中线与孔之间的区域存在缺陷。该缺陷是使用直径为1.6毫米,深度为1.8毫米的无菌钢钻孔器制造的。然后给动物注射地西泮(Bensendin,ICN Galenika,Belgrade,塞尔维亚),再用盐酸氯胺酮USP(Ketalar,Rotexmedica Gmbh,Trittau,Germany)麻醉。试验中,植入后4周处死各组动物。在提到的时间间隔之后,取出牙槽骨的脱钙样品,并且在一系列酒精浴中脱水后,制成石蜡块,取10mu;m宽的碎片并根据H&E方法进行复染以进行组织学分析。

涉及实验动物的步骤是按照塞尔维亚尼什大学医学院伦理委员会通过的“实验动物工作指南”(No 01-2625 / 2013)。

3.结果与讨论

图1是羟基磷灰石粉末,羟基磷灰石粉/壳聚糖粉末和羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸的XRD图谱。图谱中在31.8°(2 1 1),32.2°(1 1 2),32.9°(3 0 0),25.9°(0 0 2)和49.5°(2 1 3)观察到最强烈的峰,这些来源于羟基磷灰石。根据文献(国际衍射数据中心,JCPDS文件号09-432)和我们以前的研究,如此获得的HAp衍射图表明结晶很差,非化学计量形式。羟基磷灰石/ 壳聚糖的衍射图证实了羟基磷灰石和壳聚糖的存在(除了HAp的特征峰之外,在10.2°和19.7°检测到的两个反射都来自壳聚糖)。羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸的XRD图谱显示没有来自聚乳酸-羟基乙醇酸的峰,因为该聚合物是无定形的,这也与我们以前的作品的XRD研究一致。

图1. HAP,HAP/ch和HAP/ch-PLGA的XRD图谱

图2是羟基磷灰石粉末,羟基磷灰石/壳聚糖粉末和羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸的SEM图片。羟基磷灰石颗粒(图2a)的形态类似血小板,然而,用壳聚糖包覆的羟基磷灰石(图2b),与纯羟基磷灰石相比,具有更圆的颗粒。羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸(图2c)颗粒也具有球形形态。研究表明,由高能乳化剂合成和后续在离心场中加工组成的两阶段乳化工艺在促进球形复合颗粒形状方面具有重要作用。

图2. HAP,HAP/ch和HAP/ch-PLGA的SEM图谱

为了定性的确定合成的组分,我们用FTIR光谱分析了羟基磷灰石/壳聚糖粉末和羟基磷灰石/壳聚糖-聚乳酸-羟基乙醇酸(图3)。羟基磷灰石/壳聚糖粉末的拉曼光谱仅具有HAp和Ch的特征吸收带。1088和1035 cm-1处最大峰的双峰来源于羟基磷灰石的磷

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