组织工程中由具有灵敏电活性的壳聚糖/氧化石墨烯复合的水凝胶具有快速自愈和恢复行为外文翻译资料

 2022-07-02 10:07

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组织工程中由具有灵敏电活性的壳聚糖/氧化石墨烯复合的水凝胶具有快速自愈和恢复行为

摘要

目前用于电活性组织（心脏组织，骨骼肌和神经）的水凝胶具有以下缺点，例如缺乏导电性和粘附性，而这两者在水凝胶生物医学应用中起关键作用。在这项研究中，壳聚糖（CS）/石墨烯氧化物（GO）复合水凝胶具有自粘性和自愈性，以及导电性，通过掺入贻贝诱导蛋白聚多巴胺（PDA）制备。在多巴胺（DA）的氧化过程中，氧化石墨烯被PDA还原并分散到水凝胶网络中形成电通路。共价键，超分子间相互作用，氢键和pi;-pi;堆积使CS / GO复合水凝胶具有高稳定性，强机械性能，良好的粘附性，自修复性和快速恢复能力。与CS-DA水凝胶相比，CS / GO的电导率达到1.22mS / cm，并且复合水凝胶的粘合强度增加了300％。细胞培养结果表明，与CS-DA水凝胶相比，导电CS / GO水凝胶增强了人胚胎干细胞衍生的成纤维细胞（HEF1）和心肌细胞（CM）的细胞活力和增殖。此外，CM表现出比对照组更快的自发跳动率。我们的工作展示了一种简单的方法来制造在电活性组织工程应用中具有巨大潜力的基于聚多巴胺，具有粘合性，导电，自修复和快速恢复的水凝胶，其在电活性组织工程应用中具有巨大潜力。

1、介绍

由于与天然软组织和细胞外基质具有相似性以及可调性，水凝胶在组织工程学中已经引起了很多关注[1-6]。注射用水凝胶已被用于封装原位应用的细胞或药物，并与受损组织的形状相匹配。但是，在注射过程中，水凝胶通常会出现不可恢复的变形和有害的生物污染。为了解决这个问题，基于各种机制，如可逆共价键[7-11]，氢键[12]，静电相互作用[13]，离子相互作用[14]等的自修复和可注射水凝胶被提出。与共价键合的水凝胶相比，基于非共价键合的超分子键合的水凝胶容易快速降解的影响，从而阻碍其长期功能。

除了需要解决物理交联水凝胶的降解缺陷之外，已经报道导电聚合物可以促进电刺激响应细胞

的增殖和分化，如干细胞[15-18]，神经细胞[9，19,20]和心脏细胞[21]。虽然传统的导电水凝胶在细胞生长方面显示出许多优点[22]，但它们不适合在电生理条件下（如心脏应用）长期使用。这是因为在交付过程中，由于心脏的收缩行为，水凝胶将会遇到一些机械负荷[23]，这可能导致水凝胶在其服役期间破裂。最终，这些类型的水凝胶由于其非自我修复特性而不能为细胞生长提供稳定的支持。为了解决这些问题，已经开发了一系列基于壳聚糖的自修复、导电的可注射水凝胶，同时发现这类材料也是心脏修复和伤口敷料的理想候选者[7,24]。这些水凝胶的自愈性能使它们很容易在变形后恢复，这进一步延长了它们的寿命[25]。

除自愈性，导电性和可注射性外，自粘性也是组织工程中使用的水凝胶的理想性能，因为自粘性避免了额外胶带的需求，如聚丙烯酸酯粘合剂、透明胶带和绷带，同时增强对心脏，皮肤或其他组织的粘附[26,28]。富含儿茶酚和胺官能团的贻贝粘附蛋白对大多数有机和无机表面具有很高的亲和力，并且激发人们开发独特的分子多巴胺以模拟其粘附蛋白。已经发现多巴胺非常容易自聚合以产生粘附聚多巴胺（PDA），其对包括纳米填料在内的各种材料也显示出很强的结合能力。这种功能促进了纳米填料在水凝胶网络中的均匀分布，并因此产生了了新的水凝胶体系[29]。此外，还有一系列非共价键相互作用，包括在PDA链之间的氢键和pi;-pi;叠加，赋予水凝胶自稳定性[30,31]。另外，Han等人采用多巴胺作为还原剂设计了PDA / GO复合水凝胶，这些水凝胶可以用作植入式和可穿戴式设备[32]。 PDA的迷人特性（即自聚合，粘合和还原能力）使其成为GO和封端剂的合适还原剂，以稳定所得的还原GO。

壳聚糖是天然存在的多糖甲壳素的部分脱乙酰化衍生物，是一种具有良好生物相容性和可生物降解的聚合物[34]。聚阳离子性质和包括羟基和氨基团在内的反应性官能团的存在以及广泛的水凝胶粘合能力赋予壳聚糖以各种有益性能，例如生物相容性，生物降解性，可更新性，成膜性等。由于这些原因，壳聚糖应用广泛，包括人造皮肤，药物递送载体和组织工程支架[35-37]。然而，纯壳聚糖支架非常脆，这大大限制了它们的应用。为解决这一问题，使用纳米填料或配合壳聚糖与第二相聚合物可有效改善壳聚糖的理化性质。此外，壳聚糖骨架上的多官能团使其能够轻易地连接到填充材料上[38-40]。此外，壳聚糖分子中的分子间和分子内氢键强烈稳定壳聚糖的填充结构，提高其熔点，并使其仅在酸性条件下溶解[41]。

石墨烯是由蜂窝状晶格排列成的单层二维碳材料[42]，由于其优异的机械性能，较大的纵横比以及优异的导电性和光学性能，被认为是理想的聚合物纳米填料[43-45]。最近的报道也表明石墨烯有利于细胞粘附和增殖[2,46-49]。氧化石墨烯（GO）是石墨烯最重要的衍生物之一，近年来也引起了相当的关注。 GO的单分子片可以通过将氧化石墨分散在水溶液或有机溶液中来获得。其表面上的大量亲水基团，如羧基，羟基和环氧基，通过静电排斥使其在溶液中稳定分散[50,51]。此外，GO纳米片中的氧化表面官能团使其具有与许多聚合物反应的潜力[52]。据报道，由于壳聚糖薄膜具有强烈的静电相互作用，因此对壳聚糖薄膜来说非常有效的增强[53,54]。然而，关于壳聚糖/石墨烯复合水凝胶具有理想的自回弹性和粘附性的报道很少。

受天然贻贝化学的启发，我们提出了一种简单的方法来制备在室温下具有导电性、自粘性、快速自愈性和恢复性能的壳聚糖水凝胶。对于水凝胶体系，选择生物相容性聚合物壳聚糖作为骨架以提供伯胺基团; GO被用作增强纳米填料; PDA用作交联剂并在PDA还原过程中将GO部分转化为导电石墨烯。水凝胶表现出快速自愈能力，良好的粘附性和增强的可生物降解性。水凝胶的电导率为1.22 mS / cm，与天然心肌的电导率相匹配。细胞培养结果表明，导电水凝胶增强了干细胞衍生的成纤维细胞和心肌细胞（CM）的粘附。此外，CMs在水凝胶上的自发跳动速率是对照组的两倍。所有这些结果表明，本研究中提出的水凝胶是电活性组织工程应用的合适候选物。

2.材料和方法

2.1 材料

多巴胺盐酸盐，粘度为20e300cP（在1％乙酸中1wt％）的低分子量壳聚糖（Mn1 / 4,500,000,199,000）和乙酸（ACS试剂）购自SigmaeAldrich（Milwaukee，WI， 美国）。

除非另有说明，本研究中涉及的其他化学品也从SigmaeAldrich购买。 所有试剂均按收到时使用。

2.2石墨氧化物的合成与纯化

根据Marcano [55]报道的改进的Hummers的方法合成石墨氧化物。简言之，将石墨薄片（2g）和KMnO 4（12g）的混合物加入浓H 2 SO 4 / H 3 PO 4（360:40ml）的混合物中。所得混合物在50℃搅拌12小时。之后，将混合物冷却至室温，然后倒入冰（〜300g）与H 2 O 2（5ml，30wt％）的混合物中。将混合物离心（8000rpm，30分钟），倾出上清液。然后用去离子水，30％HCl，乙醇和去离子水连续洗涤剩余的固体。对于每次洗涤，将滤液离心（8000rpm，30分钟）并将上清液分离。所得固体通过去离子水透析3天进一步纯化。之后，将溶液冷冻干燥以获得氧化石墨粉末。然后通过超声处理1小时将氧化石墨粉分散在水中以获得用于未来使用的均匀的氧化石墨烯（GO）溶液。

2.3水凝胶的准备

使用制备水凝胶的典型方法，将300mg壳聚糖（CS）分散到10ml 1mg / ml GO悬浮液中，然后加入0.1mL乙酸。壳聚糖完全溶解后，在壳聚糖溶液中加入一定量的多巴胺（DA）和过硫酸铵（APS）。然后剧烈搅拌混合物并倒入5ml注射器（直径12.06mm）中。在真空脱气2分钟后，将溶液在室温下保持一夜进行凝胶化。同样，也制备了不含GO的壳聚糖水凝胶和不同的GO浓度的壳聚糖/ GO复合水凝胶。没有GO的壳聚糖/多巴胺水凝胶被命名为CS-DA。使用GO，CS / DA / GO复合水凝胶命名为CS-DA-GO＃，其中＃表示水凝胶中的GO浓度。例如，CS-DA-GO 1表示水凝胶溶液中的GO浓度为1mg / ml。使用NaIO4作为氧化剂的水凝胶也使用类似的程序制备以进行比较。图1显示了用于生产我们的水凝胶的机制示意图。

2.4性能表征

2.4.1 FTIR，UVeVis光谱学，XRD和XPS表征

纯的壳聚糖与氧化石墨烯合成的冷冻干燥的水凝胶的FTIR光谱使用Bruker Tensor 27光谱仪（Thermo Scientific Instrumentation）在透射模式下记录在4000e600 cm-1，分辨率为4 cm-1。去离子水中DA，APS氧化DA（DA：APS比例分别为1：1和1：0.5），CS，CS / DA，APS氧化的CS / DA、APS在去离子水中氧化的CS / GO / DA 的UV-Vis谱在0和24 h的UV-Vis分光光度计（Cary 500 UVeViseNIR分光光度计）上记录800 nm到250 nm。 GO、冻干CS-DA和CS-DA-GO1的X射线衍射（XRD）在具有石墨过滤的Cu-Ka源（Ka 1/4 1.54178？）的Bruker D8衍射仪上收集。

用X射线光电子能谱（XPS）分析多巴胺（DA-GO）还原的GO，DA和GO的化学组成，该光电子能谱在一个带有聚焦的单色Ka X-光电子分光计上进行， （美国赛默飞世尔科技公司）。通过XPSPEAK 4.1软件将重叠的C峰曲线拟合到它们各自的组分中。

2.4.2 形态特征

使用Tecnai 12透射电子显微镜（TEM）（FEI，USA）在120kV的加速电压下研究氧化石墨烯的形态。通过将Farmvar-carbon格栅浸入去离子水中的1％氧化石墨烯中制备样品。

将制备的水凝胶冷冻干燥以观察GO层的形态和分布。在观察之前，将干燥的水凝胶的表面溅镀金层。然后，使用3kV电压的全数字扫描电子显微镜LEO GEMINI（Zeiss，Germany）进行可视化。

2.4.3。膨胀测试

将制备的水凝胶切成10毫米长并放入10毫升PBS中的10毫升小瓶中，然后将小瓶在室温下保持24小时。之后，从小瓶中取出水凝胶，并使用Kimwipes吸收水凝胶上的表面水。使用下列等式计算水凝胶的溶胀比（SR）

SR =【（Wt- W0 ）／W0】 * 100％（1）

其中W0和Wt分别代表水凝胶膨胀后的初始重量和重量。每组测试三个样品。

2.4.4 流变测试

通过使用不同方法的TA流变仪进行水凝胶的流变学性质。 （1）进行时间扫描测试以评估水凝胶在25℃下的硬度和胶凝时间。预设应变和频率分别设定为1％和10rad / s。在收集数据之前，将500mL新鲜水凝胶溶液放置在具有500mm间隙的25mm平行板之间。 （2）将完全凝胶化的水凝胶盘（直径12.06mm，厚度2mm）置于25mm平行板之间，然后进行应变幅度扫描测试和频率扫描测试。在固定的角频率（1弧度/秒）下，应变从0.1％扫到500％。频率扫描测试中，预设应变为5％，测试范围为0.1 rad / s至100 rad / s。 （3）进行交替阶梯应变扫描测试，以使用相同的流变仪以固定的角频率（10rad / s）观察水凝胶的愈合能力。在每个应变间隔100 s内，振幅应变从小应变（g 1/4 1％）切换到随后的大应变（300％，500％，700％，900％）。

2.4.5 压缩测试

如前所述制备水凝胶并切成10mm长的圆柱体。然后，使用具有250N称重传感器的万能试验机（Instron 5967，USA）以1mm / s的速度进行压缩试验。每组测试三个样品。压缩测试结束后，将压缩的水凝胶切成两块，通过让它们在无干扰的情况下自愈1分钟进行重新塑形。然后使用相同的方法测试自愈的圆柱形水凝胶并记录Stressestrain曲线。此外，进行循环压缩测试以评估水凝胶的形状恢复和弹性特性，其特征在于在50％应变下10个循环的斜坡力加载和卸载。

2.4.6 粘合剂性能测试

按照先前的方法[56]，通过搭接剪切试验方法评估水凝胶的粘合强度。将新鲜的猪皮切成10mmtimes;10mm的正方形，并通过氰基丙烯酸酯胶粘合到铝板（宽10mm，长50mm）上。然后，将45mL水凝胶混合物施用于表皮，并将另一片猪皮置于顶部来夹持水凝胶。接触面积保持为10mmtimes;10mm。之后，在测试之前，样品在室温下胶凝2小时。然后，在室温下在具有250N测力传感器的万能测试机（Instron）上以5mm / min的速度对样品进行搭接剪切测试。所有测量都重复三次。

2.4.7。电导率测试

按照上述方法制备具有不同量的GO的水凝胶，并用于研究它们的电导率。在制备水凝胶溶液并在室温下保持一夜胶凝之后，使用便携式电导率计（Fisher Scientific，AP75便携式电导率计）测试其电导率。

2.5 生物相容性评估

2.5.1 体外细胞培养和播种

使用先前报道的方法评估了水凝胶的可浸出部分的细胞毒性，并进行了一些修改[57]。简言之，将2mL水凝胶溶液用3mL细胞培养基稀释以获得水凝胶提取物。使用从人胚胎干细胞系WA09（WiCell Research Institute）分化的HEF1成纤维细胞作为第一种细胞模型。为了使细胞接种，首先将无菌玻

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