固定化硫酸盐还原菌(SRB)颗粒的制备，用于酸性矿山废水的有效生物修复和细菌群落分析外文翻译资料

 2022-04-30 09:04

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固定化硫酸盐还原菌(SRB)颗粒的制备，用于酸性矿山废水的有效生物修复和细菌群落分析

张明亮，王海霞；济南大学资源与环境学院，济南250022

摘 要

使用上流式厌氧填充床生物反应器制备重金属抗性固定化硫酸盐还原菌(SRB)颗粒以处理含有高浓度多重金属离子的酸性矿山排水(AMD)。生物反应器表现出令人满意的性能在进水pH值2.8下和高浓度金属(Fe 463mg/L，Mn 79 mg/L，Cu 76mg/L，Cd 58mg/L和Zn 118 mg/L)。出水pH值范围为7.8-8.3，除Mn(42.1-99.3％)外，Fe，Cu，Zn和Cd的去除率均超过99.9％。 生物反应器中的细菌群落多样化，包括参与硫酸盐还原的发酵细菌和SRB(脱硫弧菌脱硫弧菌)。能够使用乳酸盐作为电子供体的共存厌氧发酵细菌(梭菌细菌等)可以解释实际乳酸盐消耗与仅基于硫酸盐还原所预期之间的差异。

关键词：酸性矿山废水、硫酸盐还原、固定化SRB颗粒、重金属

1.介绍

酸性矿山排水(AMD)是一种全球性的环境威胁，严重影响矿区周围的水生和土壤生态系统(Ackil and Koldas，2006)。到目前为止，治理AMD最常用的方法是化学沉淀(Johnson和Hallberg，2005)。然而，高的运营成本和相对较低的处理效率限制了其大规模应用。近年来，硫酸盐还原菌(SRB)对微生物修复AMD已被认为是传统方法的有希望的替代方案(Kieu等人，2011；Hao等人，2014)。在厌氧条件下，当可用碳源供应时，SRB可将硫酸盐转化为硫化物。生成的硫化物可以与金属离子一起沉淀形成稳定的金属硫化物并且产生碳酸氢盐增加AMD的碱度(常et al，2000;Benneret等人，2002)。

SRB方法在实验室生物反应器和田间试验中已显示有效地治疗AMD(Waybrant等人，2002；Boshoff等人，2004；Pruden等人，2007；Costa等人，2009；Jong和Parry，2003；Sahinkaya等人，2011)。各种操作参数的影响包括pH值、水力停留时间(HRT)、碳源、温度、硫酸盐浓度和重金属对AMD治理效率的抑制作用已经被广泛研究(Kaksonen等人，2004；Hiibel等人，2008)。然而，据报道，与使用自由悬浮的SRB有关的问题是金属毒性，其可以抑制SRB活性并且对AMD修复效率具有负面影响(Min等人，2008)。当金属离子达到一定浓度时，SRB活性将被完全抑制。可以证实，金属毒性是影响SRB治疗AMD表现的关键因素之一，尽管抑制浓度可能因不同的实验条件而变化。与AMD治理相关的另一个问题是低pH值，其严重影响微生物的生长并且降低生物反应器性能(Sheoran等人，2010；Hao等人，2014；sanchez-Andrea等人，2014)。大多数已知的SRB是中性粒细胞在pH 6-8时生长最佳，并且对酸性高度敏感，尽管近年来已报道了耐酸SRB的存在，提供了直接治理AMD的可能性(Kimura等人，2006；johnson，2014)。Kolmert和johnson(2001)报道混合嗜酸性SRB培养物能够在pH为3.0的培养基中生长。一个新型的嗜酸性SRB联合体利用在线生物反应器接收酸性矿井水，被用来选择性地从含有其他溶解金属的酸性矿水中去除铜和锌以及含有其他溶解的金属。(Nancucheo和johnson，2012)。Nancucheo等人(2012)设计了修复AMD使用的创新方法，使用模块化生物反应器去除金属的嗜酸细菌从而产生的产物具有商业价值。

在本研究中，为了解决上述两个问题，制备了新型固定化SRB污泥颗粒(SRB，污泥，零价铁，聚乙烯醇，海藻酸钠和硅砂的混合物)并评价了在低pH值条件下，对含高浓度多重金属离子的合成AMD进行有效的生物修复。由于生物反应器的操作性能可能受生物活性的显着影响，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增的细菌16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳(DGGE)来表征生物反应器中的细菌群落。

2.材料和方法

2.1 SRB污泥

从中国济南的城市污水处理厂收集过量污泥，并放入带Postgate C培养基的塑料瓶中，用于SRB污泥的厌氧培养。 使用高压蒸汽灭菌器(121℃，30分钟)将塑料瓶(耐高温)灭菌。通过直接观察黑色沉淀物、黑铅醋酸盐试验纸的形成和H2S的气味，提出了富集SRB污泥的活性。浓缩的SRB污泥在两周内形成，并离心机在5200g条件下离心10分钟后制备用于固定化。

2.2 固定SRB污泥

聚乙烯醇(PVA)和藻酸钠常常用于细胞固定化，因为它对微生物的毒性可忽略不计，且成本低(Hsu等人，2010; Min等人，2008)。将PVA(10％w/v)和海藻酸钠(1％w/v)加热直至溶解，空气冷却(40℃)，然后与浓SRB污泥(35％)，零价铁(ZVI)(5％，以促进SRB培养物作为具有高还原潜力的还原剂)和细砂(3％，以增加密度和压缩强度)的可行性。将该混合物逐滴加入含有2％氯化钙(作为交联剂)的饱和硼酸溶液中并轻轻搅拌60分钟，导致形成3-5mm直径的球形颗粒。 将凝胶颗粒浸泡在磷酸钠溶液中使其硬化，然后用去离子水洗涤三次(Hsu等人，2010；Min et al，2008)。

2.3 含锌的AMD处理的批量测试

用100毫升灭菌的玻璃瓶塞灭菌瓶，对含锌的合成AMD进行了处理。 在用新的Postgate C培养基活化后，SRB颗粒或悬浮的SRB接种物(5％接种物)同时转移到含有85,170和330mg/L Zn的Postgate C培养基的瓶中，以比较两种接种物。所有处理的初始pH调整为4.5以防止氢氧化物沉淀形成。将所有瓶子密封以在30℃的恒定温度下保持厌氧条件。最后，使用注射器定期收集样品以测定硫酸盐和Zn浓度。该批次测试一式三份进行，平均结果在研究中呈现。

采用基于Fisher LSD检验的单因素方差分析(ANOVA)，在相同采样时间内，用SPSS 16.0对不同初始Zn浓度的固定化和悬浮SRB处理之间的硫酸盐还原和Zn去除差异进行评价。Plt;0.05的概率水平被认为是统计学显著的。

2.4 上流式填充床生物反应器

用于AMD处理的上流式填充床生物反应器使用实验室规模的无菌玻璃柱(5cm直径和40cm长)。在生物反应器的两端装填硅砂(直径1.5-2mm)作为补充生物质附着介质。在生物反应器的中间填充固定的SRB颗粒。用稀硝酸将砂洗三次，然后用去离子水冲洗以消除可能的污染。使用Postgate C培养基在30plusmn;2°C厌氧条件下激活生物反应器7天以促进SRB活性，然后用蠕动泵输送AMD流入物。在活化过程中，在硅砂中形成黑色沉淀物(硫化亚铁)和硫化氢的气味显示出SRB的活性。上流式生物反应器测试一式两份进行。

通过将各种分析级盐溶解在去离子水中制备合成AMD。AMD进水组成在七个阶段中逐步改变(表格1)。

2.5 分析方法

流出物样品定期收集。收集后立即使用装有501 ORP电极的pH计(PHS-3C)进行未过滤样品的pH和Eh测量。过滤硫酸盐，可溶性金属和COD分析样品通过0.45mu;m滤纸。硫酸盐的浓度是使用Dionex ICS-90离子色谱系统测定。使用分光光度计(Spectroquant\Pharo 300，Merck Germany)进行COD的分析。在COD测量之前，将样品用浓硫酸酸化，然后用氮气喷射5-10分钟以除去溶解的硫化物(Altun等人，2014)。用火焰原子吸收光谱仪(日本岛津AA-7000)测定可溶性金属离子(Fe，Mn，Cu，Zn和Cd)的浓度。

在AMD处理结束时收集生物反应器中形成的黑色沉淀和固定化颗粒。使用场发射扫描电子显微镜(SEM，Hitachi-4800)进行沉淀物和颗粒的微观形貌观察。与SEM结合的能量分散光谱仪(EDS，INCA Energy X-MAX-50)用于沉淀物的元素分析。

根据方程式计算从乳酸氧化到硫酸盐还原的电子流量。(1)，其中生物量增长被忽略。

表格1

进水组成和生物反应器的参数。

电子流量(％)=100

其中SO4i和SO4e是进水和出水硫酸盐浓度(mg/L)，CODi和CODe分别是进水和出水COD浓度(mg/L)。

2.6.变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

收集来自颗粒和流出物样品的细胞并用于DNA提取。实验后，将颗粒样品收集在生物反应器的上部，用无菌去离子水洗涤，然后离心机在12000g条件下离心5分钟。在生物反应器过程稳定后(从第30天到实验结束)收集流出液样品，并离心机在12000g条件下离心5分钟。使用离心污泥混合物(3g)进行DNA提取。根据制造商的说明书用Power Soil DNA试剂盒(Mo-Bio，USA)提取DNA。使用通用引物对338F：5/-ACTCCTACGGGAGG CAGCAG-3\和534R-GC：5\-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGG(ATTACCGCGGCT GCTGG)-3\通过PCR扩增16S rDNA的可变V3区)。PCR扩增-在50mu;L含有11mu;L的反应混合物中进行模板DNA(2.5ng/mu;l)，11mu;l每种引物(20mu;l)，4mu;ldNTP Mix(2.5mM; Takara，大连，中国)，5mu;l10times;缓冲液(Takara)0.25mu;L标签聚合酶(5U /mu;l; Takara)和37.75mu;lddH 2 O。样品在Biometra梯度热循环仪(Whatman Biometra，德国)中进行扩增，94℃变性10分钟，然后94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，最后延伸72℃10分钟(Auvinen等人，2009;Xu等人，2011)。

用电泳(2％(w/v)琼脂糖)检测PCR产物，然后用Dcode通用突变检测系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)用于DGGE分析。在变性条件下(尿素，7M；40％甲酰胺，变性梯度范围从30％至60％)，将PCR产物置于8％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺：比例，37.5:1)上。凝胶在1Tris醋酸盐-EDTA缓冲液中在150V运行420分钟，然后银染(Campbell等人，2009)。

切出不同的DGGE条带，置于1-mL无菌离心管中进行测序。将凝胶在50mu;L洗涤-缓冲液中并在37℃保持3小时。离心机在12000g条件下离心5分钟后，将上清液转移至另一个1-mL无菌离心管中，然后加入乙醇(96％)，并将溶液在-20℃下保持2小时。然后，将溶液离心分离5分钟，37℃干燥15分钟。 缓冲液(10 lL)含有10mM Tris-HCl和1mM EDTA，用于融化纯化的DNA。在上述条件下使用DNA(11mu;L)作为扩增。用Watson凝胶回收纯化试剂盒(Watson Biotechnologies，China)纯化PCR产物，将其克隆到pMD 19-T载体(Takara)中，并根据制造商的说明书转化到大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞中。使用来自每个条带的三个随机选择的克隆的EZNATM值DNA分离系统(Omega Bio-Tek，USA)分离质粒。使用ABI 3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems)用通用引物载体M13R(26)CAGGAAACAGCTATGAC测序；M13F(47)CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(Xu等人，2011)。

将16S rDNA基因序列提交给美国国家生物技术信息中心(NCBI)并在GenBank数据库中使用BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)以获得密切相关的序列，并用于构建系统发生树(徐等人，2011)。 使用p距离模型用MEGA 4.0构建邻接系统发育树。通过bootstrap分析以1000次重复评估树(Auvinen等人，2009；徐等人，2011)。使用的序列在系统发育树的构建中，以GenBank登录号为KU254089的核苷酸数据库保存至KU254105。

3.结果与讨论

3.1.含锌的AMD的批量测试

在152小时时，固定化SRB颗粒处理的Zn的去除效率都达到99％以上(图1a)。相反，在初始浓度分别为330mg/L和170mg/L的悬浮SRB处理中，它们分别下降到49

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