曼地亚红豆杉木质水解反应研究外文翻译资料

 2022-05-24 09:05

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翻译：

摘要：目前，使用 NMR和HSQC 2D NMR技术，定量研究木质素-碳水化合物复合体（即LCC）之间的联系的定量的方法已发展起来。从天然的被研磨过的并用乙酸处理过的木质素（LCC-AcOH）和纤维素酶水解过的木质素制剂（CEL）中提取出来的木质素-碳水化合物复合体，是从火炬松和白桦木中分离出来的，并在一个常规300MHz NMR波谱和配有低温探头的950MHz光谱研究它们的特性。本文阐述了不同类型的松树和桦树木质素-碳水化合物复合体制剂（MWL、CEL、LCC-AcOH）的结构上的差异。配有低温探头的高场核磁共振的使用在LCC信号的分辨率上产生了显著的改善，并且因此对LCC间的联系的准确定量有着头等重要性。研究表明，二苄醚、gamma;-酯和LCC的苯苷间的键存在着不同含量。二苄醚基是不能被探测到的。松树中的LCC-AcOH和桦树中的MWLc制剂对苯苷和酯-LCC键的分析更可取，然而，相对地，最好用CEL制剂来研究二苄醚LCC的结构。获得的数据表明，相比于火炬松，松木含有更高的二苄醚-LCC键，却含较低的苯苷和gamma;-ester-LCC基。

关键词：木质素-碳水化合物复合体，二苄醚-LCC键，苯苷键，酯-LCC键，定量异核单量子相关谱核磁共振技术

缩略词：

LCC：Lignin–carbohydrate complex木质素-碳水化合物复合体

HSQC：Heteronuclear single quantum coherence异核单量子相关谱

2D NMR：Two-dimensional nuclear magnetic resonance (spectroscopy) 2维核磁共振

HMBC：Hetero multinuclear quantum coherence异核多键相关谱

CEL：Cellulolytic enzyme lignin纤维素酶水解过的木质素

MWL：Milled wood lignin磨木木质素

Rha：Rhamnan鼠李聚糖

Ara：Arabinan阿拉伯聚糖

Xyl：Xylan木聚糖

Man：Mannan甘露聚糖

Gal：Galactan半乳聚糖

Glc：Glucan葡聚糖

AcOH：Acetic acid乙酸

引言：多糖和木质素是构成植物的主要高分子。许多事实表明木质素和多糖是以共价键的形式存在，因此它们又称作木质素-碳水化合物复合体。尽管相对来说在木材中这些键数量较少，但它们起着很重要的作用，因为几乎所有的木头中的木质素、多糖还有大多数半纤维素都是以共价键连接的。稳定的木质素-碳水化合物共价键的出现在从木质纤维素中选择性的分离木质素和碳水化合物方面产生了重大的问题。此外，木质素和碳水化合物间的联系在生物炼制过程中也防止了木材成分有选择性的分离。因此，搞清楚LCC的结构是很重要的。然而，尽管我们已经进行了广泛的研究，我们在这块领域的知识仍然不够。这是因为LCC的结构天生就是非常复杂的，这就造成了研究出这方面让人们信赖并有益的方法的困难。

目前，对于LCC的分析，不同的分析方法的优势和劣势正在审查中。我们在LCC的结构上获得的大量信息，是模仿了LCC的构造和反应，还来自于湿法化学降解技术。后者是基于具体的产品的分析，而这些产品因LCC制剂选择性的降解，随后原生LCC成分在结构上的演绎从而导致了这些降解产品的产生。

现在，人们认为在木头中木质素-碳水化合物联系的主要形式是苯基糖苷键，酯和二苄醚。尽管从湿法化学降解技术和建模实验中获得的信息非常珍贵，但直接观察LCC结构的方法的发展也有着首要的重要性。但是，用光谱技术对LCC结构直接分析是非常困难的，这是由于在各种光谱中强烈的信号重叠，包括和NMR谱，而这被广泛用于木质素和碳水化合物的分析。

2D NMR方法的应用克服了这些障碍，并且在从软木和硬木分离出的制剂中观察到了LCC间的各种各样的连接。在2D核磁共振谱上一个异核单量子相关谱第一次直接测到了二苄醚和苯苷与LCC的联系。与大众认可的相比之下，没有观测到苄基酯和LCC间的联系，反而我们在LCC制剂的异核单量子相关谱上发现了gamma;-酯和LCC的联系，这是使用长程异核多键相关谱技术证实的。

使用2D NMR方法证实各种各样的LCC的联系是在LCC研究领域的一个重大的里程碑。但是，这些LCC成分的定量研究是头等重要的。使用传统的湿法化学降解技术定量研究LCC间的联系是有限制的，原因是与木质素相关的碳水化合物位点的相对量化。木质素和碳水化合物间的各种各样形式的联系上的定量信息是非常少的。Obst评估，每100个单体木质素单元中，松树和山杨树的CEL中，二苄醚和酯与LCC间的键分别是2.2-2.5,0.3-0.6个。

由于LCC间的键的信号与其他的碳水化合物和木质素的信号严重重叠，用1D NMR定量研究LCC键几乎是不可能的。虽然2D NMR方法克服了重叠问题并且允许探测LCC的结构，但到目前为止依旧做不到定量。然而，几年前，有人试图去量化HSQC光谱。

目前，人们正使用两种不同方法研究：一个是将检测到的结构总量作为100%的综合二维频谱，另一个是异核单量子相关谱和核磁共振的结合。第一个方法只能估计各种信号的相对比例，例如，估算不同含氧脂族木质素结构的百分比，前提是假设被识别的部分的总和为100%，但这个方法无法提供绝对值。结合异核单量子相关谱和核磁共振这个定量的方法的使用，在定量核磁共振谱上使用合适的共振，作为一种内部引用，从相应的2D光谱中获得的相对集成值转换为绝对值。这种方法已在磨木中提取的木质素和纤维素中得到证实，并且结果非常可靠。

材料和方法：

木质素的分离：

在不同的LCC和木质素制剂的分离之前，用苯乙醇萃取松树桦树锯末（小于60目）

天然的磨木木质素（MWLc）：

根据经典方法（Bjorkman 1956）分离天然磨木木质素，即在目前的实验中用行星式球磨机和用振动球磨机对比。萃取得到2g锯末，并用ZrO2钵和9个ZrO2球研磨5个小时，600转每分钟。获得的木粉用96%v/v的二氧六环萃取，然后所得溶液在35℃真空下蒸发。除去二氧六环，加几滴水到固体里再次蒸发，重复三次。最后，固体物质在35°C的真空烘箱中干燥，从而获得了MWLc制剂。

提纯MWL（MWLp）：

将上面获得的药品溶解在90%的乙酸中（20ml/g木质素），并且逐滴加入10ml/ml的90%木质素溶液中以沉淀，再依次洗涤，冷冻干燥，溶解在二氯乙烷-乙醇混合物中（比例为1:1）。溶液逐滴加入含10ml/ml的二氯乙烷-乙醇的乙醚以沉淀。获得的沉淀经过过滤，用乙醚和石油醚洗涤，再干燥，就获得了MWLp制剂。

LCC-AcOH：

在上面的沉淀过程中，把上层清液收集于水中，在真空下蒸发知道干燥。除去ACOH，加几滴水到干燥的固体物质中并且再次蒸发，重复三次。最后，干燥的固体物质在35℃的真空烘箱中烘干，就获得了LCC-AcOH。产率大概是30-40%（MWLc）或者10-15%（原木中的木质素）

松树中获得的LCC-AcOH收率要高一些，约70%（MWLc）或者22%（原木中的木质素），对松木锯末经过持续15h的研磨而得到，备注为PLCC-AcOHhy。

碱处理LCC-AcOH（LCC-AcOH-Alk）：

温和条件下（室温，氮气作保护气，一整晚）将松树LCC-AcOH进行皂化，阳离子交换树脂中和反应混合物。中和后的溶液进行过滤，冷冻干燥，就得到了LCC-AcOH-Alk。

碱预萃取木头分离桦树MWL（MWLa）：

从碱预萃取硬木中分离出来的MWL制剂（即MWLa）含有相当低数量的碳水化合物。基于这个结果，桦树MWLa被用作不含LCC的制剂的参考。碱预萃取的苯乙醇在含0.3%NaOH的液体（液体与木材比为50）回流下进行。然后过滤，水洗，干燥，分离出固体物质。从碱预萃取中分离出MWLa，与上面描述的从常规的木材中分离MWLc是同一种方法进行操作的

纤维素酶水解过的木质素（CEL）：

MWL提取后的残渣用来分离CEL，跟原始协定中很相似。残渣用水洗后，用加有纤维素酶的醋酸盐缓冲液（PH=4.8）在45℃下处理48h。酶的电荷是每克木材中500U。酶水解之后，通过离心，缓冲液清洗再去离子水洗，然后冷冻干燥，分离出固体物质。随后固体物质用96%的二氧六环萃取，并用与得到MWLc的同样的步骤处理得到所要产品。

碳水化合物的分析：

LCC制剂的碳水化合物成分是通过用Saeman法分析LCC中的多糖然后用离子交换色谱量化得到的糖确定的。大约每20mg制剂用1.0mL的浓度为72%的硫酸水解，并在室温下搅拌2h。之后用去离子水稀释混合物得到浓度为3%的硫酸，然后把它转移到一个小瓶子里并密封，在120℃的高压锅内加热5h。过滤所得的悬浮液，稀释所得滤液得到合适浓度的单糖（0.1-0.2mg/ml），以便用带有脉冲电流计检测器的Dionex-3000色谱系统进行分析。用0.45mu;m特氟龙注射器过滤器过滤溶液斌注入25mu;L到Dionex系统中，使用串联的Carbo-Pac保护柱和分析柱完成糖的分离。水作洗脱液且流率为1.0mL/min，柱子的温度保持在18℃，加入后柱基以便提高脉冲电流测量法的检测能力，海藻糖被用作内部标准。

核磁共振分析：

所有的核磁共振谱都是在25摄氏度下的DMSO-d6中用Shigemi核磁共振微管获得的。Bruker AVANCE 300MHz光谱仪上得到定量的核磁共振谱，这个光谱仪配有一个5mm的QNP探针，探针能使用封闭的反质子，还能在之前描述的条件下解耦顺序。样本的浓度大约为25%。乙酰丙酮铬在定量核磁共振获得前就添加到核磁共振管中，以提供所有原子核的完全释放。采集参数包括90°脉宽，1.7s的松弛延迟，1.2s的采集时间，并且总共收集了20万份扫描。

在样本浓度约为10%情况下，2DHSQC核磁共振谱要么在配有BBI探针的Bruker AVANCE 300MHz光谱仪上获得，要么在配有一个冷沉淀台和一个Bruker 5mmID CPTCI（）（它带有一个Z轴梯度光谱仪）的Avance III 950MHz光谱仪。

结果和讨论：

1.LCCC研究的制剂的离析

针对从木材中离析LCC制剂提出和讨论了各种方法，然而没有一种方法能弄清楚单个的LCC制剂的结构所有方面，例如组成，碳水化合物和木质素部分的结构，LCC连接形式，碳水化合物和木质素的连接位点，分子量，和分子量分布等等。因此，LCC制剂的选择取决于研究目的。

目前的研究集中于核磁共振对不同形式的LCC连接的定量分析。最理想的情况是，最有代表性的能阐明木材原地中LCC 连接的制剂将是包括目前存在于木材中所有的木质素/LCC，例如，完全溶解的细胞壁制剂。但由于不同碳水化合物的含量高并且包含非常低浓度的LCC键，这些制剂成分非常复杂。因此，尽管主要的木质素成分的核磁共振分析是很成功的，在这些制剂中LCC键的量化将会比富含LCC键的具体制剂要困难得多。

因为在木材中木质素和碳水化合物的连接的浓度明显很低，生产一种富含LCC成分以在核磁共振谱中获得相当大强度的信号就显得很重要了。我们之前的研究表明，称为LCC-AcOH的制剂富含LCC片段，因此使用核磁共振法分析LCC间的联系是前景诱人的。然而，很明显它代表了木质素的一小部分，并在研磨过程中经历了严重的讲解。所以，LCC间的连接也会被破坏。相比来说，CEL就是较少被降解的木质素制剂。我们的初步试验表明，除了传统木质素特征外，它也会对二维核磁共振对二苄醚和 LCC间的键有帮忙。因此，LCC-AcOH和CEL制剂的对比也是很有趣的。

从木材中分离LCC制剂需要球磨机把细胞壁基质破坏到一种允许木质素和LCC片段进行萃取的程度。用96%的二氧六环萃取研磨过的木材可以生产MWLc。用90%NaOH分馏MWLc可以获得一种称为富含LCC-AcOH制剂的LCC和提纯的MWL。纯化后的松树MWL（即PMWLp）含有很少含量的糖，这表明大多数含有天然的MWL的LCC结构集中于PLCC-AcOH制剂中。同样的情况下，桦树MWLc的分馏不是这样的结果，当桦树提纯时，含有很多的糖。因此，桦树MWLc，LCC-AcOH和MWLp制剂含有LCC成分，并且因此需要更多具体细节的研究调查。

在用球磨机（强度䄦加工时间）的时候，制剂的产量赫尔 所用的能量成比例关系。研磨强度

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