聚苯乙烯纳米颗粒可能会影响细胞有丝分裂并损害哺乳动物的早期胚胎发育外文翻译资料

 2022-08-11 11:08

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聚苯乙烯纳米颗粒可能会影响细胞有丝分裂并损害哺乳动物的早期胚胎发育

关键字:牛 牛胚胎 牛输卵管上皮细胞 聚苯乙烯纳米粒子

摘要

围绕生物医学应用的纳米颗粒(NPs)的开发比如药物输送和癌症治疗引起了极大的兴趣。然而,纳米级材料与生物之间的相互作用。然而,纳米级材料与生物之间的相互作用和相关的危害尚未完全阐明。在这项研究中,牛输卵管上皮细胞(BOEC)和胚胎被用作体外模型,以研究细胞是否有丝分裂和哺乳动物早期胚胎发育可能受到暴露于聚苯乙烯(PS)纳米颗粒的影响。 对暴露于PS-NPs的BOEC进行的核型分析未显示染色体与对照组相比异常,尽管在对照组中观察到更多的四倍体中期板。体外受精实验旨在了解暴露于PS-NPs是否会影响植入前的发育,结果表明,与PS-NPs孵育可以剂量依赖的方式降低8-细胞胚胎和囊胚率。 以平均细胞百分数表示的胚泡质量与对照相比,暴露的胚泡中具有片段化DNA的卵裂球相同。这些结果表明,暴露于PS-NPs可能会损害发育。 反过来,这可能会影响胚胎中的有丝分裂并导致到达胚泡阶段的发育能力降低。这个表示应仔细监测在环境中的释放以及随后PS-NPs向生物或生物体内的积累,以防止可能损害其复制率的细胞毒性作用。

  1. 引言

由各种材料制成的纳米颗粒(NPs)在大小,形状和表面功能部分方面均不相同,已用于许多生物医学和技术应用中。NPs目前用于医疗保健(例如靶向药物输送,诊断和再生医学),电子产品,化妆品,纺织品,信息技术和环境保护。由给定的大块物质制成的NPs与活生物体相互作用的方式以及它们进入人体的程度可以通过改变其外表面的物理化学性质(例如通过化学键接各种功能部分)来改变。最近的证据表明,纳米颗粒碎片正在环境和我们的组织中积聚,并呼吁进行研究以评估纳米颗粒对生物体可能造成的威胁。

在医疗保健行业中,过去20年来,人们对聚苯乙烯(PS)纳米颗粒的兴趣一直在稳定增长,这主要是因为PS既没有表现出短期的细胞毒性,也不会在细胞环境中会降解,聚苯乙烯纳米颗粒(PS-NPs)也很容易以各种尺寸合成,并且许多不同的官能团易于接枝到颗粒外表面。这些特性使聚苯乙烯纳米颗粒非常适合用作模型颗粒,以研究其尺寸和表面特性对生物的影响。

最近,在海洋垃圾中发现了聚苯乙烯纳米粒子,并在双壳纲,甲壳纲和海洋沿海鸟类物种的组织中证实了它们的存在【1-4】,这表明了通过食物链释放到环境中的纳米粒子的生物蓄积机制。 此外,由聚苯乙烯纳米塑料引起的胚胎发育异常。在淡水甲壳类动物银河蚤盖氏水蚤中已有报道【5】。

在脊椎动物中,NPs与肝毒性,神经毒性,肾毒性和不可逆的睾丸损伤等疾病有关【6-13】,越来越多的证据表明,某些形式的纳米材料可能具有潜在的生殖毒性,并且可能阻碍胚胎发育。 尽管很难比较从母亲到发育中的胎儿的纳米材料的运输,但几位作者证明了PS-NPs可以穿越小鼠和人的胎盘【14.15】,并对哺乳动物的繁殖和胎儿发育构成潜在的威胁【16-18】。

本文中,我们提出了一项旨在调查是否暴露于聚苯乙烯纳米粒子可能会影响细胞有丝分裂和早期哺乳动物胚胎发育的研究。与牛输卵管上皮细胞(BOECs)培养相比,纳米粒子对牛胚胎发育早期的细胞毒性特征。

  1. 材料与方法

2.1、材料

除非另有说明,否则用于细胞培养的生化试剂,化学药品,酶,试剂盒,培养基,污渍和水均购自Sigma Chemical Co.(意大利米兰)。 荧光绿色标记(发射波长468/508 nm)标称直径为44 nm的聚苯乙烯纳米粒子购自Duke Scientific Corporation(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托)。使用与以前的研究相同的PS-NP,部分是为了与它保持一致,部分是因为这些纳米粒子表现出窄的单分散尺寸分布(直径为43.67士1.08 nm,多分散指数为0.09 【19】)。在其外表面具有净负电荷(zeta;电位为--25.25土5.26 【19】)。这些特性使它们成为测试NP细胞内在化和NP对大型哺乳动物生殖生物学的影响的有趣的NP模型。

2.2、卵母细胞采集与体外成熟

从屠宰场的牛中收集卵巢,并在2-3小时内运送到实验室。通过用19号针抽吸单个卵泡收集卵母细胞复合物(COC),然后在Hepes-TALP【19】中洗涤。COC(n = 608)在补充了50mu;g/ mL的M199中成熟。庆大霉素,1 mg / mL的两性霉素B,10%的胎牛血清和10ng / mL的表皮生长因子在39°C,空气中5%CO2,湿度95%的环境中持续22-24小时。

2.3、精子制备

从五头公牛的五个精液中抽出的冷冻牛精液(0.5 ml吸管;每个吸管约4010°精子;解冻后活力gt; 70%)从Inseme S.p.a(意大利摩德纳的San Giuliano Saliceta)获得。将吸管在38°C的水浴中融化30秒钟,并在10 mL精子TALP培养基【20】[中以170 g离心10分钟冲洗。重悬于1 ml IVF-TALP中后【20】分别补充了终浓度分别为20、10和1mu;M的青霉素,250mu;M次牛磺酸,25mu;M肾上腺素(PHE-mix)的混合物,评估了回收的精子的浓度和运动性。为此,使用了放置在加热到39°C的显微镜载物台上的Makler腔室,并通过连接到Basler Vision Technology A312 FC相机(德国阿伦斯堡)的Nikon TE 2000(日本Tokio)倒置显微镜进行了分析。正相差10倍物镜。至少400个电池和四个采集并分析每个精液样本的区域。 使用Sperm类分析器(SCA Microptic S.L,西班牙巴塞罗那)对曲线速度(VCL),直线速度(VSL)和平均路径速度(VAP)进行了评估。使用了以下软件设置:25帧/秒,10帧/物体,慢精子的速度极限为10mm/s,平均精子的速度极限为25mm/s,快速精子的速度极限为50mm/s,50%最小线性度,和70%直线度,用于进行性快速精子。

2.4、体外受精与胚胎培养

为了受精,用250mu;l精子悬浮液(1x10%/mL精子终浓度)对悬浮于250mu;lIVF-TALP中的50个体外成熟的COC组进行授精,并加入肝素使其终浓度为10微克/毫升(n = 3)。在39°C和5%CO2下共孵育18-20h后,将COC转移到Hepes-TALP中,并通过涡旋除去积云细胞【21】。预先收集假定的受精卵,在补充了5%FCS的合成输卵管液中洗涤,分为4组:PS-NP 10ug/mL,PS-NP 100ug/mL,对照10ug/mL(CTRL 10mu;g/mL)和100mu;g/mL(CTRL 100mu;g/mL)。对于对照,将10和100 ug/ml的PS-NPs悬浮液通过0.02mu;m孔平滤器(Whatman,Maidstone,英国)过滤,以回收载体,制造商未指明其化学性质。合子在39%的5%CO2、5%02和90%N2气态气氛中于50°C的700mu;ulSOF中孵育7天。于受精后第3天测定卵裂率和8-细胞胚率(8-细胞胚/卵裂胚)。在感染后第8天确定胚泡发生率(胚泡/卵裂的胚胎),将胚泡(n=145)固定并用TUNEL和Hoechst染色标记,如下所述,以评估胚泡平均细胞数,TUNEL阳性细胞的平均百分比,共聚焦显微镜观察PS-NPs的内在化。

2.5、TUNEL法

通过TUNEL测定法测量囊胚(n = 145个囊胚)中的DNA片段化。通过末端脱氧核苷酸转移酶,用异硫氰酸荧光素偶联的dUTP(FITC-dUTP)标记DNA的末端3-0H末端。

在d8 pi时,将对照和PS-NPs暴露的受精卵生成的胚泡固定在 在室温下PBS中4%的多聚甲醛在室温下放置4小时,在补充有3 mg / mL聚乙烯醇(PBS-PVA)的PBS中洗涤3次,每次10分钟,然后在0.1%Triton X-100和0.1%柠檬酸钠中渗透 在4℃放置30分钟,最后在PBS-PVA中洗涤3次,每次10分钟。

然后按照制造商的说明将胚泡在TUNEL反应混合物中于37℃在黑暗中孵育1小时。在孵育时间结束时,如上所述,将胚泡在PBS-PVA中洗涤,并在室温下用10mu;g/ mL Hoechst 33342标记7分钟,再次洗涤,然后安装在Leica上并在Leica上进行分析 TCS SP5共焦显微镜(德国韦茨拉尔),配备了具有63倍油浸物镜的Diode UV(405 nm)和Argon(488 nm)激光器,针孔尺寸为95.5mu;m,截面厚度为0.77mu;m,Z形堆叠20 mu;m,图像分辨率为1024 x 1024像素,在100Hz频率下评估人胚泡细胞数,TUNEL阳性细胞百分比和NPs内在化。在每个实验中,通过省略末端脱氧核苷酸转移酶来制备阴性对照 在反应混合物中。通过在室温下用1 mg / ml DNase I预处理10分钟来制备阳性对照。

2.6、细胞培养与染色体制备

为了更深入地了解PS-NPs在细胞分裂过程中的作用,在存在PS-NPs的情况下培养了牛输卵管上皮细胞(BOEC)。从当地屠宰场收集牛输卵管,并在4°C下用补充有50mu;ug/ml庆大霉素的Dulbecco PBS(DPBS)运送到实验室。通过挤压从单个动物的输卵管中回收上皮细胞的层。在补充有50mu;g/ml庆大霉素,1mu;g/ml两性霉素B和10%FCS的M199培养基中,在10 cm培养皿(Falcon,Becton Dickinson,Milan,Iltaly)中进行贴壁细胞培养,在38.5。C,5%二氧化碳,湿度95%条件下,将BOECs在10mu;g/ml FITC-PS-NPs(美国加利福尼亚州杜克科学公司)存在下培养7天,直至达到细胞融合。作为对照,在没有NPs的相同条件下培养细胞。但是,将通过10 kDa过滤器离心而获得的NPs悬浮液的渗透物添加到培养基中。 为此,将NPs悬浮液离心,在112 Amicon超0.5毫升离心过滤器中以5000克的压力处理15分钟蛋白质纯化和浓缩(Millipore,米兰,意大利)。每48小时用一次新鲜培养基替换用过的培养基。在第70小时加入秋水仙碱(0.3 mg / ml),并在第72小时收获细胞。培养结束时,将细胞单层与0.25%胰蛋白酶(GIBCO 15050,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)一起孵育,冲洗,在M199培养基中处理并通过以下方法进行染色体制备。低渗治疗(0.5%KCI,20分钟)和Camoy固定剂3:1(甲醇:乙酸)进行多次更改,直到获得澄清的沉淀为止。通过风干法制备玻片,并在5%的Giemsa溶液中于Sorensen缓冲液(pH 7.0)中染色6--8分钟。根据Odierna et al., 2004。【22】

2.7、染色体分析

通过在光学显微镜下观察,由对照和经PS-NPs处理的BOEC的培养物确定染色体的数目和形态。最佳中期用CCD相机拍摄,并用CytoVision NT Genus系统v3.6(美国加利福尼亚州圣何塞的应用公司MAGING)进行半自动染色体核型重建。 每组检查大约200个中期。

2.8、统计分析

以卵裂率、8细胞胚胎率、囊胚率、TUNEL率和四倍体中期细胞率为累积百分数,采用Fisher精确检验进行评价。囊胚平均细胞数分析采用方差分析(SAS/STAT,CARY,NC,USA),当检测到总体显著性时,采用Tukey的诚实显著性差异检验进行配对比较。

3、结果

3.1、NPs的内化与定位

共聚焦分析表明,PS-NP在胚胎和BOEC中的有效内在化。 图1显示PS-NPS主要存在于卵裂球细胞质中并形成小的离散簇。 在原子核中找不到它们。 弥散的细胞质信号和小NP簇的形成与我们先前的研究相符【19】。

图1.PS-NPs在8细胞胚胎(A)和囊胚(B)中的内化。PS-NPs用绿色表示,细胞核用蓝色表示。

3.2、NPS对体外受精和胚胎发育的影响

设计体外受精实验以研究暴露于PS-NPs是否对牛植入前发育有任何影响。图2显示,在d3 pi时,对照组和暴露于不同浓度NPs的胚胎的裂解率没有显着差异(CTRL 10ug/mL:87.3,PS-NPs 10mu;g/mL:85.5,Pgt; 0.05; CTRL 100 ug/mL:86,PS-NPs 100ug/mL:85,P>0.05。图2还显示,暴露于PS-NPs导致剂量依赖性地降低了8个细胞的胚胎率(CTRL 10 ug / mL:64.6,PS-NPs 10mu;g/mL:41.9,P lt;0.01; CTRL 100 ug /mL:64.3,PS NP 100ug / mL:28.4,P<0.01)。值得注意的是,在最高的NPs浓度下,囊胚率的下降最为显着(CTRL 10 ug / mL:41.7,PS-NPs 10 ug / mL:30.4,Pgt; 0.05; CTRL 100 ug / mL:25,PS-NPs 100 ug / mL:13.7,P lt;0.05)。图3和图4显示,根据平均细胞数(CTRL 10mu;g/ mL:102.55土44.54,PS-NPs 10 ug / mL:97.2土38.06,Pgt; 0.05; CTRL 100 ug /mL:103.43土44.57,PS-NPs 100 ug / mL:98.36土29.68,Pgt; 0.05)和具有碎片DNA的卵裂球的百分比(CTRL 10mu;g/ mL:7.7%)PS-NPs 10 ug / mL:8.5%,Pgt; 0.05; CTRL 100 ug / mL:8.3,PS-NPs 100 ug / mL:7.9%,Pgt;0.05)。

图2.PS-NPs暴露对第3天卵裂率(白条)和8细胞胚胎(灰条)的影响,以及对第8天囊胚发

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