基于力谱的形貌和力学同步表征 对海藻酸盐包覆微球中聚合物-聚合物相互作用的研究外文翻译资料

 2022-08-08 09:08

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基于力谱的形貌和力学同步表征

对海藻酸盐包覆微球中聚合物-聚合物相互作用的研究

载细胞的水凝胶微球在药物传递、组织工程或再生医学等领域展现了令人鼓舞的结果。除了经典的单一聚阳离子涂层外，许多其他不同的涂层设计已被报道，其目的是改善力学性能和微球的体内性能。其中最常见的策略是包括额外的聚阳离子涂层和半透膜的共价键生物相容性交联剂，如genipin。然而，它仍然具有挑战性的特征之间的相互作用的影响，聚阳离子和水凝胶微球随时间在体外。在这里，我们使用基于力谱的同时形貌和机械表征来研究不同涂层设计的海藻酸盐微球中的聚合物-聚合物相互作用，使水凝胶保持在液体中。除了经典的形貌参数，我们首次探索了峰/谷特征沿z轴的演化，通过阈值分析以及形貌和刚度剖面之间的相互关系，分辨率可低至数十纳米。因此，我们证明了genipin交联对避免双聚阳离子涂层海藻酸微球膜剥离的重要性。总的来说，这种方法可以改善水凝胶的设计原理，加快体外表征，从而促进基于水凝胶的技术的临床转化。

以水凝胶为基础的纳米、微观和宏观技术对生物医学研究至关重要，并具有通过组织工程等应用促进临床医学发展的越来越大的潜力,再生医学,药,生物传感器, bioinks、疫苗和细胞疗法的封装。在这些生物技术中，固定化治疗细胞的聚合物基质涂层半透性。到目前为止，膜已经在多种病理的治疗中显示了令人鼓舞的临床结果。经过四十年的研究，藻酸盐-聚阳离子-藻酸盐(APA，使用聚赖氨酸或聚鸟氨酸)微球仍然是设计的选择。然而，由于这种微球缺乏长期稳定性和较差的力学性能，最终导致其在体内的生物安全性受到损害。

为了解决这些问题，微球的性能已经通过使用额外的聚阳离子涂层和/或在半透膜中的共价键得到了提高。特别地，天然水溶性化合物genipin正成为一种流行的交联剂，用于增强微球膜在植入过程中和植入后的稳定性，部分原因是它的毒性极小，易于在微球制造中实现。此外，研究表明，聚阳离子链与genipin之间的共价锚固也可能增加APA微球植入体内时的整体生物相容性。由于这些原因，引入更复杂和复杂的涂层设计需要深入研究微球表面及其在这一技术的整体改进中的意义。

目前，褐藻酸盐化学成分对异物反应的影响，无论是定性还是定量，都是该领域研究的热点相反，对于微球表面的聚合物-聚合物相互作用及其对植入体最终成功的影响，研究较少。例如，聚阳离子链与藻酸盐基质的结合效率与体内生物相容性之间有很强的相关性。具体来说，据报道，游离和暴露的聚阳离子导致更多的免疫原性膜，这是种植失败的主要原因。因此，为了最终完善用于临床实践的生物系统设计，迫切需要技术来帮助阐明导致植入失败的机制。

在这种情况下，原子力显微镜(AFM)是表征表面形貌的强大工具，也可以作为表征分子间相互作用的代理。此外，AFM的亚纳米分辨率和在渗透相关的液体环境中工作的能力使其成为表征水凝胶的理想材料。因为AFM的样品制备不需要干燥、固定、过交联或对比，所以对水凝胶结构或孔径的损害是最小的。尽管AFM在微球表征方面具有明显的优势，但由于报道了表征液体环境中水凝胶基球形基底的形貌的复杂性，在评估微球在液体中的形貌方面的工作还很少。事实上，AFM是一项困难的技术，它需要一个精确的校准标准，并且吞吐量低。然而，表征水凝胶的形貌和力学特性的好处使该技术独特而有价值。特别是，AFM可以帮助微调微球的组成，确定批次之间的异质性和推断微球的生物相容性机会。

在这项研究中，我们使用了基于力谱的AFM成像来表征(即形貌和刚度)不同涂层设计微球的表面特性，包括我们最近开发的genipin交联双聚赖氨酸(GDP)膜。除了标准的形貌参数，我们首次提出通过阈值分析评估Z轴的峰/谷特征，以及同时获得的微球表面的形貌和机械图的相关性。我们的结果提供了藻酸盐基质/聚阳离子相互作用的详细信息，并揭示了genipin介导的锚碇在避免双涂层微球膜剥离和暴露免疫原群的重要性。

我们在37°C的培养皿中，在液体(无血清DMEM)中进行了基于力光谱的AFM测量。放置在培养皿中的尼龙网固定了微球，没有任何脱水步骤或可能改变水凝胶结构和性质的额外处理(图1a，左，图S1)。同时通过纳米压痕测量(即纳米压痕测量)收集形貌(金)和刚度(蓝色)值。(图1a，右)。这个设置允许三个不同大小的正方形图像。所有的形貌图都用热图(图1b)表示，可以进行3D渲染(图1c)。一般视图(100 mu;m2)提供了表面规律性的整体印象;而分析视图(9 mu;m2)提供了采样和地表分辨率的最佳平衡。最后，详细视图(0.25 mu;m2)提供了单纳米的分辨率，并允许研究山谷和微球表面的较小特征。据我们所知，这是第一次报道藻酸盐微球在液体环境中的形貌分辨率(图S2中的代表性图像)。

此外，我们还计算了杨氏模(即杨氏模)。从一个赫兹模型拟合力谱测量。由于AFM能够将材料中数百纳米以下的表面表征出来，由此产生的热图(图1d)不仅提供了表面刚度的总体测量，还提供了胶囊形貌上每个点的空间分布刚度。

利用上述实验装置，我们研究了双聚赖氨酸(PLL)涂层和金尼平交联对微球表面性能的影响。为了更彻底地探索这些成分的效果，我们省略了最后0.1%的海藻酸盐涂层通常用于微球。我们表征了四种不同的微球组成：经典海藻酸盐- pll配方(AP)；AP与genipin交联(APG)，AP与第二PLL涂层(APP)，最后是我们最近开发的genipin交联双聚l -赖氨酸膜(GDP)(图2a)。我们通过zeta电位测试了单或双锁相环涂层的正确掺入。与预期的一样，APP和GDP设计显示，与仅涂有一层PLL涂层的AP和APG组相比，净负电荷显著减少(两种情况下，**p = 0.0012)(图S3a)。此外，由于genipin在交联完成后会发出远红外荧光，因此我们将该信号作为微球半透膜交联度的指标进行测量。APG组和GDP组都显示了成功的交联膜(关于AP， *p = 0.011和**p = 0.0049)。而且，GDP设计的荧光强度比APG高7倍，证实了该组具有更高的共价锚固程度(**p = 0.0049)(图S3b)。

图1 AFM方法获得的形貌和刚度图的代表性图像

(a)固定化藻酸盐微球的装置示意图(左)，以及形貌和刚度测量结果地图(右)。尼龙网固定了微球，允许在液体中稳定测量。插图说明了微球顶部悬臂的凹陷，以获取力光谱测量。从力谱得到的数据被表示为形貌图(金色)，杨氏模量被计算和表示为刚度图(蓝色)。(b)海藻酸微球的代表性形貌图像。每个微球获得三种尺寸的贴图，100mu;m2全貌(左)，9mu;m2分析视图(中间)，和一个0.25mu;m2详细的视图(右)。尺度是优化，以提供最佳的对比，每个图像。值得注意的是，放大倍数越高，最佳缩放范围越小。(c) (b)中所示形貌图的三维表示。(d)与(b)中所示地图同时获得的刚度图。

我们开始用经典的形貌参数(图S4)表征这些微球：最大图像高度(MIH)、Ra、RMS、总表面积(TSA)和偏度。我们比较了不同组成的微球与经典AP微球的结果。

图2四种不同涂层设计的形貌

(a)研究中不同海藻酸盐微球的示意图(上图)，各组具有代表性的10times;10mu;m地物图像的一般视图(中间)，地物图像的三维重建图(下图)。计算了海藻酸盐微球的标准形貌参数；(b)最大图像高度。(c) Ra；(d) RMS；(e)表面积；(f)偏度。n=每组至少4个样本。方框表示四分位数范围：须表示极大值和极小值。在样本通过正态性检验后，对除偏度外的所有形貌参数采用Bonferroni事后检验的单因素方差分析。未配对、双尾t检验用于偏度(APP-GDP比较)。* p lt; 0.05;* * p lt; 0.01;***与AP组比较p lt; 0.001；#APP-GDP比较p lt; 0.05。

MIH(图2b)是扫描图像中最高点和最低点之间的最大距离，是对表面振幅的测量(图S4a)。我们发现，APP(双涂层)微球产生的形貌明显高于AP(250plusmn;15nm，增加60%，**p=0.0060)。有趣的是，将两个PLL层与genipin (GDP微球)交联后，产生的MIH值与AP没有显著差异(增加43%，220plusmn;18 nm)，这表明genipin在微球表面的扁平化中起作用。

然后我们测量了Ra沿不同微球表面的变化(图2c)。Ra是粗糙度的量度，计算为感兴趣的表面偏离平面的距离(图S4b中的参数说明)。我们发现APP和GDP的Ra值明显高于AP。有趣的是，APP的Ra值增加了70% (***p lt; 0.0001)，而GDP的Ra值比AP增加了61%。

图3 不同海藻酸盐微球的阈值分析结果

(a)对一个形貌实例(左图，深蓝色)进行剖分(用金色表示的平面)，以说明最大图像高度(MIH)的10、20(山谷分析)、80和90%(峰分析)的阈值分析。这些部分的结果在右侧的代表图像中进行了描述。在MIH的80%以上的峰值所对应的区域用红色标出，在MIH的20%以下的山谷所对应的区域也用红色标出；(b)在MIH阈值的80%处，通过颗粒分析计算的平均峰值直径；(c)在MIH的20%阈值处，通过粒度分析计算的平均谷径。阈值图像的Xy尺度为3times;3micro;m，z尺度为74nm；(d)绝对值谷地总积，通过谷物分析计算，与(c)类似。n =每组至少5个样本。所有的图都描述了平均值plusmn;标准误差的平均值。用Bonferroni事后检验进行单因素方差分析。 #APP-GDP比较p lt; 0.05。

对照(**p = 0.001)，表明只有APP和GDP(双涂层微球)比AP对照粗糙。Ra值通常与其他粗糙度参数一起计算，如RMS(图2d)。与Ra不同，RMS将偏差计算为曲面和平面定义的曲线下的面积(图S4b)。当我们研究这个参数时，结果与Ra类似。

TSA还给出了表面总体粗糙度的概念(图S4c)。TSA值越高，表面整体粗糙度越高。APP的值(11plusmn;0.22mu;m)(图2e)与AP(10plusmn;0.31mu;m)相比，显著增加9.1%(*p = 0.044)。相反，AP、APG和GDP之间没有显著差异。

最后，我们评估偏度，即使用一半的MIH作为参考，表示表面整体高度分布的对称性(或缺乏对称性)(图2f)。换句话说，它表明了一个表面的规则性(例如，在整体平坦的形貌中出现几个高峰会导致较高的偏度值)(图S4d)。在偏度方面，我们观察到APP和GDP之间存在显著差异(#p = 0.026)，这再次表明了在第二次PLL涂层后，genipin交联对微球形貌的强烈影响。这表明峰值在GDP中的优势较低，因此生成的表面比APP微球更均匀和对称。

为了进一步表征双涂层和热尼平对微球表面性能的影响，我们接下来对微球的形貌进行了阈值分析。这种分析包括选择不同的图像高度，并在选择的高度生成图像的一部分。通常，这些高度以MIH的百分比表示(图3a)。

按照这个过程，我们定义了一个阈值来研究我们的形貌的峰值，位于MIH的80%处(图3a，峰值阈值)。在满足此阈值的图像上，我们进行了晶粒分析，并研究了每个微球组成的平均峰值直径(图3b)。我们在所有的比较中都没有发现显著的差异。

图4 不同海藻酸盐微球的z轴阈值分析

(a)在两种不同的峰值模型中，由不同高度的阈值所产生的截面示意图。(b)(a)所示模型峰沿z轴执行的阈值的峰直径模型图。该图还说明了delta;峰直径·delta; z参数minus;1 用于后续面板及其在(a)中描述的两种模型情况下的变化。(c)delta;峰值直径·delta; zminus;1 通过对图S5a中不同微球组的80、85和90%阈值进行直线拟合计算得出。(d)delta;谷径·delta; zminus;1 对20、15、10%阈值进行直线拟合计算，如图S5b所示。(e)delta;谷体积·<em

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