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低碳/氮(C/N)生活污水部分反硝化工艺生产亚硝酸盐的研究：性能、动力学及微生物群落
Shenbin Cao a, Rui Du b, Baikun Li b, Shuying Wang b, Nanqi Ren a, Yongzhen Peng a,b,uArr;
a中国，哈尔滨150090，哈尔滨工业大学，城市水资源与水环境国家重点实验室
b中国，北京10 0124，北京科技大学，北京工程技术研究中心，城市污水处理与回用先进技术国家工程实验室
摘要
以乙酸盐为唯一碳源的部分反硝化法已成功地用于生产亚硝酸盐。本研究以生活污水中的碳源和少量的外部有机物为原料，首次研制了以高硝酸盐为原料的部分反硝化序批式反应器（SBR）。结果表明，添加生活污水不会使PD作用减弱，在173天的操作期间，亚硝酸盐向硝酸盐转化率保持在90%，仍可获得较高的亚硝酸盐产量。通过优化硝酸盐和生活污水的供给量以及外部碳源投加量，对于在生活污水进水体积为2.8L，硝酸盐含量为0.4L的条件下，为1.46，为1.32的厌氧氨氧化工艺，PD出水是适宜的，在此条件下外部需碳量降低至为1.7。硝酸盐还原速度符合Monod kinetics（莫诺德动力学），最大比还原速度为4.56gN/gVSS/D，硝酸盐半饱和常数为6.9mg N/L。高通量测序分析表明，随着生活污水的增加，微生物群落的多样性增加，但是在denitrifiers of Thaura genus（塔乌拉属反硝化细菌）的作用下，亚硝酸盐的高产量仍在PD反应器中占主导地位，占54.9%-72.9%。这项研究表明，高硝酸盐和生活污水可以通过新的PD-ANAMMOX（部分反硝化-厌氧氨氮化）工艺以一种成本效益高的方式被同时处理。
关键词:部分反硝化；高硝酸盐；生活废水；厌氧氨氧化；动力学；高通量测序分析
亮点
1.高亚硝酸盐产量增加，NTR达到90%左右。
2.部分反硝化出水可用作厌氧氨氧化工艺的投料源。
3.增加生活污水后，对部分反硝化的外部碳需求量降低。
4.比还原速度高达4.56 N/g VSS/d。
5.负责亚硝酸盐生产的Thauera属占54.9%~72.9%。
图文摘要
1.引言
摘要自养厌氧氨氧化是以亚硝酸盐为电子受体，将氨氧化为氮气的电子受体，被认为是最具经济价值的脱氮工艺。其具有去除效率高、能耗低的优点。然而，稳定获取一直是厌氧氨氧化法联合部分硝化（PD）处理含氨废水的瓶颈，尤其是对低底物污水而言。另一方面，在脱氮过程中的产生,作为用于厌氧氨氧化提供电子供体的替代技术,近年来引起了人们的广泛关注。在间歇流模式下，的积累率可达到60%.因此，对于含硝酸盐污水来说，反硝化在厌氧氨氧化过程中具有很大的潜力，这是一种经济而有效的合成的方法。
反硝化作用下的亚硝酸盐积累量受到微生物群落结构的严重影响。据报道，反硝化群落的组成可根据其还原硝酸盐和亚硝酸盐的相对能力分为三类，其中一组有利于亚硝酸盐累积。在我们之前的研究中，对亚硝酸盐积累量高的反硝化污泥进行了筛选，并利用合成含硝酸盐污水进行了培养，长期运行获得的硝酸盐向亚硝酸盐转化率(NTR)率高达80%。部分反硝化工艺(PD)被用于对含过量硝酸盐的厌氧氨氧化污水进行深度脱氮处理。由于厌氧氨氧化法需要亚硝酸盐和氨的底物，故采用结合部分反硝化工艺(PD)的厌氧氨氧化法处理含硝酸盐污水时一般需要含氨污水。因此，生活污水(主要含有氨氮和有机物)是一个很好的选择，因为它提供氨，减少外部碳源消耗。适用于部分反硝化，以及低成本的脱氮工艺。
然而，在反硝化过程中，在我们先前的研究中，以乙酸钠为唯一碳源来培养高亚硝酸盐产量的反硝化作用，亚硝酸盐积累量被碳源类型影响。生活污水中含有易生物降解的有机物质(例如乙酸、丙酸)和难生物降解的有机物(例如多糖类和蛋白质)，这将影响PD工艺中碳源的消耗。因此，需要对对生活污水处理的PD工艺进行进一步的研究，并对亚硝酸根的生产状况进行评价。
由于PD工艺出水作为厌氧氨氧化工艺的投料源，其出水水质应满足厌氧氨氧化工艺的要求。首先，PD工艺出水中亚硝酸盐与氨浓度的比值应接近理论值1.32，硝酸盐浓度应尽可能低，这样才能在厌氧氨氧化工艺中获得理想的脱氮效果。此外，PD工艺出水中可能仍含有一定数量的有机物，有机物会对ANAMMOX菌产生不利影响。一种有效的方法是优化PD工艺反应器中硝酸盐和含氨污水的投加量，控制出水有机物的浓度。
本研究的目的是阐明，在使用实际生活污水时，高亚硝酸盐的生产状况是否会变弱。在实验室规模的测序间歇反应器(SBR)中研究了加入硝酸盐和生活污水的PD工艺和用乙酸钠作为唯一碳源且NTR在80%以上培养的接种污泥。此外，还对PD工艺出水进行了评价，并对进水进行了优化处理，使得后续厌氧氨氧化工艺达到最佳进水量。为了更好地了解功能型细菌的动态，采用Illumina高通量测序法对PD-SBR(部分反硝化序批式反应器)中的微生物群落进行了分析。
2.材料和方法
2.1部分反硝化工艺实验装置
在高度为70 cm，内径为10 cm的5-L序批式反应器(SBR)中进行了PD工艺。这个SBR反应器在室温(18.5°C~28.6°C)下运行，采用一个悬臂式搅拌器将污泥悬浮在水中(图1a)。硝酸盐污水、实际生活污水和外部碳源被储存在三个储罐中，分别提供给SBR反应器。SBR反应器运行的循环时间为2h，包括8分钟的硝酸盐和生活污水的投加，2分钟的加外部碳源， 缺氧15~20分钟，沉淀10分钟，脱氮5分钟，闲置75-80分钟产生亚硝酸盐(图1b)。在供水期，高硝酸盐污水0.3~0.4 L和2.5-2.8L的生活污水被抽入SBR反应器内，在体积交换率约为60%的条件下，沉降后排放。SBR反应器的运行由自动控制系统控制。除此之外，还定期进行循环研究，测定铵、亚硝酸盐、化学需氧量(COD)、混合液悬浮固体(MLSS，SS)和混合液挥发性悬浮固体(MLVSS，VSS)浓度。
2.2污水和接种污泥
在25L桶中制备硝酸盐污水，浓度为1000mgN/L，硝酸盐污水由硝酸钠(NaNO3，151.8g/25L)和自来水合成。生活污水取自北京科技大学（北京，中国）住宅区的化粪池。该生活污水的特征是碳氮比(C/N)低，约为3.2。该生活污水主要参数为：
接种污泥取自我们实验室的PD工艺浓缩系统。接种污泥用含合成硝酸盐的污水培养，以乙酸钠作为唯一碳源。在长期运行中，接种污泥具有良好的稳定性，硝酸盐-亚硝酸盐转化率在80%以上。接种后MLSS和MLVSS分别为3.5g/L和2.0g/L。
2.3反应程序
在SBR反应器中对PD工艺系统投加硝酸盐和生活污水，为期173天，它可以根据不同的进水量以及不同的外部碳源剂量，分为6个阶段。在运行1中(1-7天)，硝酸盐和生活污水投加量分别为0.3L和2.5L，外加碳源投加量设定值0.5。在运行2中(8-30天)，值提高到1.0。在运行3中(31-41天)，生活污水和无变化，硝酸盐污水投加量增加到0.4L。在运行4中(42-68天)时，生活污水增加到2.8L。两种类型的废水投加量在后续运行中保持不变，值在运行5中(69-133天)增加到1.5,在第6阶段中(134-173天)增加到1.7。
图.1. SBR中部分反硝化实验装置(a)和运行模式(b)
2.4批量试验
在不同浓度和不同生活污水投加量下，为考察部分反硝化活性(包括比硝酸盐还原速度和亚硝酸盐产生速度)，进行了间歇试验。在温度为26.0°C的条件下，在有效体积为500 ml的密封锥形瓶中进行了实验。用去离子水冲洗从PD反应器中提取的污泥3次，并将每批试验中的污泥浓度MLVSS控制在0.5-1g/L。将抽入反应器5 min，建立缺氧环境。磁力搅拌器的使用速度约为每分钟150转，以提供完全混合。试验持续60分钟，每隔5分钟用无菌注射器取一次混合液样品，进行硝酸盐和亚硝酸盐分析。在每次试验结束时，分三份测量MLVSS浓度，并根据底物浓度的降低和生物量浓度的降低来估算部分反硝化活性。
2.5.化学分析
每天采集进水和出水样品，并立即进行分析。用Lachat QuikChem8500流动注射分析仪(Lachat Instrument,Milwaukee, USA)分析铵、亚硝酸盐和硝酸盐的浓度，用化学需氧量快速分析仪(Lian-hua Tech. Co., Ltd., 5B-1, China)对COD进行分析。按标准方法测定混合液悬浮固体浓度(MLSS/SS)和MLVSS。用WTW 340i型pH探头(德国WTW公司)测量pH值和温度。
2.6典型循环中NTR的计算
其中，分别为和初始浓度，和分别为和的取样点浓度。
2.7通过高通量测序分析微生物群落
在第40、92和143天的运行中，对部分反硝化SBR反应器中的污泥样品进行了对微生物群落结构的动态分析。收集的样本首先由Labcono(Model 195, England)冻干，然后根据制造商的指示，用快速DNA试剂盒(BIO101，Vista，CA)从干污泥(0.10-0.20g)中提取DNA。用聚合酶链反应(PCR)扩增16S核糖体RNA(rRNA)基因。引物338 F和806R针对的是细菌16S rRNA基因V3区和V4区。
根据[22]的描述进行PCR反应。PCR产物在美国Majorbio Bio-Pames技术有限公司(中国上海)的Illumina MiSeq PE300平台上进行测序。分类学分类是使用MOTHUR软件用97%的同一性阈值(即3%的不同水平)将优化的序列确定为操作分类单元(OTUS)。将样品的OTU数作为物种丰富度计算，生成稀疏曲线和多样性指数。生成的污泥样本的原始序列由Silva分配，以修剪适配器和条形码。
3.结果与讨论
3.1局部反硝化在长期运行中的表现
PD-SBR根据硝酸盐进水量、生活污水和外部碳源，运行173天，总计6次。，，和COD在长期操作过程中的操作参数的变化，如图2和表1所示。初始阶段的进水硝酸盐量和生活污水量分别为0.3和2.5L。由于生活污水(平均比约为3.2)中的有机物，在运行1(0-7天)时，将外加碳量设置为为0.5。反应器一启动，浓度就达到了30.6mg/L，获得了理想的部分反硝化反应，然而出水中残留大量(平均为34.3 mg/L)，说明部分反硝化碳源不足。主要原因是生活污水中部分有机物难以生物降解，不能被反硝化细菌直接利用，出水COD浓度(平均84.9mg/L，图2B)对此进行了验证。
运行1周后，在运行2(8~30天)时，外部碳源投加量提高到为1.0。出水含量增加，平均值为39.1mg/L，含量相对下降到平均22.2mg/L(表1)。由于部分反硝化出水将是后续厌氧反应器的进水，出水相对于相对较高。因此，在运行3(31~41天)时，进水提高到0.4L。出水急剧增加，平均值为37.4mg/L。此外，出水量略有增加，平均值为42.2mg/L，主要是由于生活污水中有机物数量和/或质量变化所致，外部碳源量并没有增加。在运行4(42~68天)时，外部碳源量提高到为1.5(图2A)，出水量明显增加。量高达58.2mg/L，出水量降至24.2mg/L。
由于生活污水中呈下降趋势，在运行5(69-133天)时，生活污水进水量提高到2.8L，外碳投加量保持在为1.5。出水平均为58.8mg/L，略高于运行4(58.2mg/L)，出水相应降至17.2mg/L，这主要是由生活污水中有机物的增加引起的。需要注意的是，由于外部给碳用蠕动泵出现故障，在第88天外碳投加量飙升至为4.5(图2A)。因此，出水急剧下降，第89天未被检测到。此外，出水有机物浓度大幅度提高到200 mg COD/L(图2B)。为了避免部分反硝化的崩溃，外部碳投加量迅速恢复到为1.5，SBR中的污泥用自来水冲洗三次，去除残留有机物。因此，出水迅速恢复到原来的水平，并在随后的44天内稳定下来。运行中的这一调整表明部分反硝化具有承受高有机质冲击的能力。
为进一步降低出水浓度，在运行6(134-173 天)时，外碳投加量增加到为1.7。得到了一种理想的亚硝酸盐生产工艺，出水值平均高达68.2mg/L，在运行40天后趋于稳定。出水平均COD值约为88.6 mg/L。由于水力停留时间长，反硝化细菌可在以下厌氧反应器中利用相对较高的有机物，外部碳用量不再进一步增加，出水值仍为9.6mg/L。
3.2PD-SBR典型循环中的亚硝酸盐生产
对典型的部分反硝化循环中、和COD的变化进行了监测(图3)。由于有机物的含量不足以进行完全的部分反硝化，因此在所有运行过程中都观察到了两个不同的还原阶段(图3A-d)。外碳源(乙酸钠)与生活污水中易降解有机物的反硝化作用提供电子供体，硝酸盐以相对较高的速度被还原，没有外部碳源的反硝化作用利用生物物质的内部碳源和生活污水中的难降解有机物提供电子供体，硝酸盐是其中的一种，减少的速度要低得多。这两个阶段可以用COD曲线清晰地描绘出来，该曲线最初迅速下降，然后保持在一定的值。
每周监测的pH值显示，连续4圈(400 Min)，外碳投加量的为1.5(图3e)。随着反应的进行，pH值逐渐增大，然后在部分反硝化结束时略有下降，这与完全反硝化过程中的pH曲线相似。然而，在部分反硝化过程(还原成)中没有产生碱度。只有在还原成时才能产生碱度。部分反硝化过程中pH值的增加主要是由于外碳源(乙酸钠)在这项研究中作为强碱盐而产生的，其中会随着的消耗而产生。此外，pd反应结束时pH值略有下降，主要原因是二氧化碳(
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