蛋白质有效分子印迹的挑战外文翻译资料

 2022-08-07 15:20:08

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蛋白质有效分子印迹的挑战

Ellen Verheyen 1 , Joris P. Schillemans 1 , Martin van Wijk, Marie-Astrid Demeniex, Wim E. Hennink,Cornelus F. van Nostrum*

摘要

分子印迹是一种通过在模板分子周围形成聚合物网络来创造人工受体的技术。这种技术已被证明对于低分子量(lt;1500Da)的分子特别有效，而在过去的五年里，有关较大（生物）模板印迹的研究文章数量正在显著增加。然而，将印迹材料的方法扩展到蛋白质、DNA、病毒和细菌的选择性识别似乎是极具挑战性的。本文对几位作者提出和我们自己的实验数据进行了评价性地分析，表明蛋白质的分子印迹仍然面临一些根本性的挑战。主要关注的主题是适当的单体选择 、洗脱方法即模板的去除、再结合的量化和再现性。使用带电的单体可以导致单体和模板之间的强静电相互作用，但也会导致不需要的高特异性结合。到目前为止，还没有令人信服地证明静电相互作用会导致更好的印迹结果的证据。理想情况下应该避免通常用于模板去除的洗涤剂SDS和AcOH的残留而导致的实验伪影的结果。在许多情况下，模板再结合无法可靠地量化，结果没有得到关键性地评价，缺乏统计分析。因此可以说，目前在许多出版物中蛋白质分子印迹的科学证据并不令人信服。

1.介绍

分子印迹是一种通过在模板分子周围形成聚合物网络来创建人工受体的技术。在预聚合物的混合物中，有几种可能的相互作用如疏水相互作用、氢键、范德华力和静电相互作用确定了模板周围单体的空间排列，然后通过单体和交联剂的聚合来固定这种空间排列。去除模板会在聚合物网络中留下化学和空间互补的空隙（印迹），从而能够再结合模板。

虽然第一篇描述印迹形成的论文是在1931[1]年发表的，但在20世纪80年代之前，对分子印迹的研究一直都很少。在Whitcombe等人的一次权威而全面的调查总结中，通过过去20年（附图2A）[2]所展现出的出版物数量的急剧增加，说明了该领域的日渐成熟。从此项和许多其他调查评论中描述的多年来已经取得的进展，可以很明显看到，分子印迹是一种前景优越且技术发展迅速并具有许多可能的应用的技术，如分析分离、酶样催化、化学传感器和药物输送等[2-6]。

分子印迹已证明对低分子量化合物特别成功[7-10]。虽然对于更大、更复杂如蛋白质、DNA的分子甚至整个细胞和病毒的印迹也有报道[11-14]，但使用这种模板进行研究的论文数量仍相对较少（附图2B）。截至2003年，每年发表的生物大分子印迹研究论文不到10篇，这反映了试图印迹大而复杂的生物分子时所面临的困难[15,16]。首先，对于低分子量化合物，可以使用高度交联的凝胶来确保模板去除后的印迹腔的保存，然而，对于大模板分子，高交联密度严重阻碍了模板的传质，导致模板去除和再结合动力学的缓慢，并且在最坏的情况下，由于物理固定会导致模板在聚合物网络中被永久包封。此外，交联连接到网络中的模板也可以被化学固定化。其次，由于生物大分子的溶解度特性和结构性质敏感，印迹一般只能是在水环境中进行，这限制了单体的选择[17]。第二，氢键的相互作用有效地促进了分子印迹聚合物(MIPs)在有机、质子溶剂中对低分子量化合物的亲和力，但在水中则会受到严重地阻碍。第三，生物大分子是高度复杂的，例如带电荷性或疏水性等物理化学性质在不同的区域有很大的差异。而与蛋白质模板类似的区域可能存在于其他模板中，这可能导致高特异性结合和交叉反应印迹聚合物的产生。

Fig.1：分子印迹原理的示意图表示。（A）：模板（以蓝色表示)，(功能)单体(以黄色，绿色和橙色表示)和交联剂（＋）形成预聚合物。（B）：单体和交联剂的聚合修复了复合物。（C）：删除该模板将会留下再结合的空腔。经许可后，可再结合，其内容取自于[1].

尽管存在挑战，但在生物大分子印记相对于该领域的其他领域的最初滞后之后(附图2），现在论文的数量已经开始增加了。有趣的是，附图3表明，近些年(2005-2009)，模型蛋白质蛋白、血红蛋白和溶菌酶类较2006年以前（44%）被更频繁地使用（54%）。这与一个新兴的研究领域所期望的预期结果相反，并表明蛋白质的分子印迹仍处于其最初的发展阶段，研究主要集中在使用明确定义、相对稳定和廉价的模型蛋白质的概念证明上。我们相信，特别是在这个研究强度不断增加，概念证明和制定未来研究标准的时期，对已发表的数据进行严格地验证审查是很重要的。因此，本文的目的是批判性地分析已发表的数据和与我们自己的实验数据有关的结论。所讨论的文章是从2001年至2009年期间发表的论文并在进行广泛的文献研究的基础上选择的，我们把重点放在载有足够数据以允许分析和重新计算的出版物上。我们要强调，本章提出的观点只是为了引起辩论，我们无意诋毁任何人。

Fig.2：（A）：1931-2009年期间分子印迹科学和技术领域内每年的出版物数量（改编自[3]，并辅以[16]的数据）；（B）：1985-2009年期间每年生物大分子印迹研究论文数。

Fig.3：用于蛋白质分子印迹的模板在1985-2006和2007-2009期间的相对频率。

2.实验基础

2.1材料

丙烯酰胺(AAm，超纯)和N,Nrsquo;-亚甲基-双丙烯酰胺(MBA，超纯)是从MP生物医学公司购买的；甲基丙烯酸(MA，99%)、N,Nrsquo;-双（丙烯酰基）胱胺、荧光素异硫氰酸酯、来源于母鸡蛋清中的溶菌酶类(96,381U/mg)；牛心细胞色素C（纯度gt;95%)、牛血红蛋白(纯度gt;90%)、马心肌红蛋白(纯度gt;90%）和N-octyl beta;-D-葡萄糖醛苷(OG)来自西奥尔德里奇。乙酸(ACOH)、丙烯酸（AAC、合成等级）和N，N二甲基甲酰胺p都是从默克公司获得的。N,N,N,Nrsquo;-四乙基乙二胺(TEMED)、过氧二硫酸铵(APS)和十二烷基硫酸钠(SDS)都是从弗卢克公司获得的。N,N-二甲基乙酰胺乙基-甲基丙烯酰胺(DMAEMA)是从Polysciences欧洲有限公司获得的。Bio-RadDC蛋白测定是从Bio-Rad实验室购买的。二酰磷脂酰胆碱(DOPC)来自于脂蛋白H；TritonX100(TX100)来自于BDH实验室用品，Irgacure2959来自于Ciba专业化学品。 脂质II是一种与细菌膜相关的肽聚糖前体，是由E.Breukink博士（乌得勒支大学)提供的。 如[19]前所述，合成了FITC标记的溶菌酶。详细说明：将300mg溶菌酶溶解于50mL硼酸盐缓冲液中（100mm，pH为9）。搅拌时，将0.28mLFITC溶液（在DMF中含量为10mg/mL，FITC：赖氨酸摩尔比1：20）加入到溶菌酶溶液中，并在室温下搅拌1h。接下来，通过添加硼酸将pH调整到7.2，并过滤蛋白质溶液(0.2mm)。 最后，将溶液广泛透析（时间为一周，温度保持在4℃），以去除未反应的FITC，冷冻干燥后收集FITC溶菌酶。

2.2表面涂有溶菌酶印迹的聚丙烯酰胺水凝胶层

该方法采纳于Matsunaga等人的方法[20]。首先，在甲醇中加入5mM的双丙烯酰胞胺，用乙烯基改性表面等离子体共振(SPR)芯片(1times;1cm，Biacore)的金表面，培养30min。然后，用甲醇和反渗透水洗涤芯片5次。将72.2mgAAm，13.6mgMBA，12mu;LAAc(10%w/w在10mM HEP ES，pH调整为pH7.4，摩尔比AAM：MBA：AAC=11：1：0.2）和50mg溶菌酶溶解，制备预聚合物混合物，总体积为1mL10mM HEPES（pH7.4）。在不添加AAC的情况下，制备了中性预聚合物混合物，用氮气冲洗5min后，加入10mu;LAPS(10%w/w）。将组分混合，并将50mL混合液浸入金表面，在37℃下聚合3h。用3倍5mL 1M氯化钠和3倍5mL反渗透水冲洗，去除模板。以同样的方式制备非印迹聚合物，但不添加溶菌酶。在10mM HEPES、pH7.4的表面中加入40mu;L、30mg/mL FITC-溶菌酶溶液进行再结合研究。室温培养1.5h后，用10mM HEPES(pH7.4)冲洗表面3次，以去除未结合的蛋白。并用尼康TE-2000倒置荧光显微镜观察了绑定的FITC-溶菌酶。

2.3细胞色素C印迹水凝胶的制备与分析

合成是根据Kimhi和Bianco-Peled的论文内容进行的[21]。详细地说，0.86g AAm，0.2g MBA，1.025mL MA和2.05mL DMAEMA(摩尔比AAm：MBA：MA：DMAEMA=10：1：10：10)和0.2g细胞色素C溶于10mM HEPES缓冲液中溶解(最终体积10mL，pH调整为7.4)。预聚合物混合物用氮气冲洗10min，除去氧气。接下来，加入70mL APS（反渗透水中含量为1.5%w/w）和0.56mL TEMED（10mM HEPES缓冲液中含3.75%，pH调整至7.4）以引发聚合。这些凝胶可以在室温下聚合过夜，然后使用IKA超透平管驱动器打磨表面，并通过一个80毫米的筛子进行湿筛。用100mL反渗透水，100mL 1M NaCl，100mL 10%SDS：AcOH和200mL反渗透水连续洗涤，从颗粒凝胶颗粒中去除模板。采用微板法测定洗涤组分中的蛋白质浓度[22]。接下来，将颗粒冷冻干燥，并在室温下储存。以同样的方式制备非印迹聚合物，但不添加细胞色素C。

在加入4mL细胞色素C或溶酶菌溶液之前，用50mg干颗粒进行再结合，用1mL pH为8的TRIS-HCL缓冲液水合(最终浓度范围为 0.5-4mg/mL)。在室温下的辊道台培养一夜后，将颗粒进行沉积（在10分钟内视觉上完全沉积），过滤后，用分光光度法测定上清液中残留的蛋白质，并使用校准曲线(A410下细胞色素C的E11=86[23]、A280下溶菌酶的E11=2.7[24])。

2.4培养和离心后肌叶蛋白恢复

作为对照实验，评价了实验条件对不含任何聚合物的溶液中蛋白质浓度的影响。在10 Mm HEPES pH7.4中，将含有200mL(0.05、0.15、0.25、0.35和0.45mg/mL)肌红蛋白溶液的Eppendorf软管在辊道上室温培养6h。将样品在22.000g下离心15分钟，并使用校准曲线测量410nm下的吸光度，并测定上清液中的血红蛋白浓度(E11=157 [25])。

2.5血红蛋白印迹水凝胶的制备与分析

中性蛋白印迹聚丙烯酰胺氢凝胶基本上如上述进行合成[26,27]。详细地说，将270 mg AAm、30mg MBA（摩尔比19：1）和40 mg牛血红蛋白在5mL的反渗透水中溶解。用氮气将预聚合物混合物冲洗10分钟，以去除氧气。下一步，加入50mL APS(反渗透水中含20%w/w，pH调整为7.4)和50mL TEMED(反渗透水中含10%v/v，pH调整为7.4)引发聚合。这些凝胶可以在室温下聚合过夜，然后使用IKA超透平管驱动器打磨表面，并通过一个80毫米的筛子进行湿筛。用100mL反渗透水、100mL 10%SDS和300mL反渗透水连续洗涤，从颗粒中去除模板。用分光光度法测定洗涤分数中的血红蛋白浓度（在A410下，绘制了反渗透水和10%SDS中的血红蛋白校准曲线）。通过在洗涤组分中加入氯化钾，验证了SDS的去除效果。非印迹（对照）聚合物以相同的方式制备，但不添加模板蛋白。

模板提取后，用pH6.8的磷酸盐缓冲液（PB，10mM）调节凝胶颗粒。通过在40℃下在真空烤箱中培养2h来确定所得颗粒悬浮液的干重量。随后，将20mg干聚合物(约300mg湿聚合物)对应的MIP和NIP悬浮液固定量转移到2mL管中，加入pH6.8的PB缓冲液，总重量为0.5g。 随后，在pH6.8的PB中加入血红蛋白，最终浓度为0.125mg/mL至1.0mg/mL(总体积为1.65mL)由于MIP和NIP的湿颗粒的体积并不完全相同，因此血红蛋白的确切浓度在添加后立即确定（C0）。在培养一夜后，将样品离心（15.000g，2分钟），并过滤（0.2mm）以去除剩余的凝胶颗粒。然后用分光光度法测定经滤过的上清液中的蛋白质浓度（A410）。

2.6脂质II-表面印迹的纳米粒子

除了使用挤压材料来制备DOPC脂质体之外，如之前报道的我们采用脂质体纳米反应器合成了交联聚丙烯酰胺纳米粒子(10%w/v的总单体，AAM：MBA：AAC=32：8：1w/w，摩尔比=9.6：1：0.27)。脂质II(LII)以每1333mol磷脂、1mol LII的比率结合到脂质体LII中。简而言之，将DOPC（2mu;mol）和LII（1.5nmol）溶解于氯仿置于圆底烧瓶中。使用旋转蒸发器在减压下制备脂质膜，并在氮气流下进一步干燥。接下来，在10 mM HEPES pH7.4中加入0.8mL单体溶液，最终磷脂浓度为2.5mM。 将Irgacure2959（光引发剂）添加到0.01%(w/v)的浓度溶液中。随后，所形成的多层材料使用手工挤出机（抗极性脂质体）通过孔径为0.1mm的聚碳酸酯过滤器挤压脂质体。为防止脂质体外的单体发生聚合反应，在光照前立即将溶于HEPES(130mg/mL，pH调整为7.4)中的200mL抗坏血酸加入到脂质体分散体中。光聚合是通过使用蓝光4 UVC汞灯(150W，lambda;-范围230-600nm，HonleUV技术)在N2气氛下照明90s启动的。

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