1-己基-3-甲基咪唑鎓离子液体用于分析药物制剂中三环类抗抑郁药外文翻译资料

 2022-04-28 10:04

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附录 译文

1-己基-3-甲基咪唑鎓离子液体用于分析药物制剂中三环类抗抑郁药

S. Calabuig-Hernaacute;ndez, E. Peris-Garciacute;a, M.C. Garciacute;a-Alvarez-Coque, M.J. Ruiz-Angel

西班牙瓦里埃尼西亚大学屈伊米亚分校，C·Moliner博士

摘 要

本文以乙腈-水作为流动相，在不存在和存在离子液体1-己基-3-甲基咪唑氯化物和1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的情况下，研究了六种三环抗抑郁药(阿米替林、氯米帕明、多塞平、丙咪嗪、去甲替林和马普替林)的反相色谱行为。离子液体能改善这些碱性化合物的分离，表现为保留时间的延长和峰形的改善。三环类抗抑郁药极性较低，能与常规固定相的烷基链强烈缔合。由于其强碱性，它们在反相液相色谱中的正常工作pH范围(2-8)带正电。因此，它们可以与常规硅基固定相中存在的残留离子化硅烷醇相互作用，导致其在固定相上有很强的保留，色谱峰拖尾并展宽。采用C8柱和含有30%乙腈/10 mm氯化1-己基-3-甲基咪唑(pH=3)的流动相并用UV检测建立了一种药物制剂中三环类抗抑郁剂的色谱方法。日内和日间精度通常低于 1.0％，日内和日间偏差（正确度）分别介于-2.1％和 2.4％之间，-3.0％和 2.3％之间。 样品制备简单，只需要在注射前进行溶解和过滤。

关键词：三环抗抑郁剂 1-己基-3-甲基咪唑氯化物 制剂方法验证

  1. 引言

在反相液相色谱(RPLC)中，碱性药物通常在pH 2-8范围内带正电荷，这意味着，碱性药物除了与常规C18固定相的烷基链的相互作用外，还容易被碳十八烷基柱中的带负电荷的残余硅烷醇吸引，导致用Si载体衍生过程出现立体异构问题[1,2]。由于与硅烷醇的相互作用动力学缓慢，色谱峰保留时间延长，拖尾并展宽。

近十年来，离子液体(IL)作为一种高效的碱性药物峰型增强剂在RPLC中得到了广泛的关注。在HPLC中使用的众多离子液体中，有几位作者报告说，由1-己基-3-甲基咪唑(HMIM)阳离子、阴离子氯化物和四氟硼酸盐形成的那些离子液体对于碱性化合物的分离具有一下特点：色谱峰较窄，保留率较小，有机溶剂消耗量较低[3-8]。出现这些特点是由于离子液体的阳离子和阴离子都能够与固定相相互作用[9]。在C18固定相上，HMIM的吸附相对于阳离子1-乙基-和1-丁基-3-甲基咪唑(BMIM)、阴离子氯化物、四氟蹦酸盐显著增强。事实上，一种更好的增强剂是1-辛基-3-甲基咪唑鎓阳离子（对于HMIM有较强的吸附作用）[10]，但由于其溶解性差而未被使用。

在RPLC中使用IL作为流动相添加剂的文献较多。最近一篇综述收集了130篇参考文献，发表至于2015年[11]。大多数的研究都集中在色谱分离的基本方面[12-16]。但是，开发的程序通常不需要对真实的样本进行阀值或应用，忽略了IL对基本方面的影响，如线性、重复性和稳定性。

这项工作的目标是开发一个简单的RPLC程序，其中包含一个含有IL的流动相，并通过广泛的验证来评估程序在常规分析中的稳定性。在这项研究中，选择了六种三环类抗抑郁药(TCA)。该程序适用于药物制剂中TCA的分析并且验证遵循国际协调会议(ICH)指南[17]。

TCAS经常用于治疗精神障碍，因为它们能有效地提高患者的情绪，甚至对儿童和青少年也有较好的功效[18-20]。因为分析程序对这些药物的分析高效，选择性好，重现性好，对生物样品中这些药物的分析至关重要，但药物样品也需要常规方法。动态分离技术包括RPLC [20-25]，毛细管电泳(CE)[26-28]和气相色谱(GC)[29-32]，已用于TCA的分析。在这些技术中，由于RPLC操作简单，分离能力强，分析时间短，重现性好，样品应用广泛，被认为是最有效和最稳定的。

TCAS具有由三环组成的化学结构，侧链为N-烷基甲基胺或N-烷基二甲基胺[20]。环结构决定了辛醇-水分配系数(log Po /w)在3.9-5.3范围内的相对较低的极性，而胺基赋予它们基本特征，其pKa值在9.0-9.7范围内[33]。低极性的TCA与常规C18固定相的烷基链强烈缔合，这要求流动相中有机溶剂含量高以获得足够短的分析时间。此外，它们的基本特征有利于与残留硅醇的相互作用，这会造成峰的拖尾，其大小取决于柱的种类[34]。为了解决这个问题，离子和非离子表面活性剂偶尔会加入到流动相中以改善TCA的色谱性能，但是并不完全达到满意结果[35-38]。由于这个原因，预计含有HMIM阳离子的IL在流动相中的加入可以显示RPLC分析TCA的独特性能。

最近一项研究比较了一组TCA的色谱性能，使用与氯化物或六氟磷酸盐相关的BMIM作为流动相调节剂[39]。BMIM阳离子可以延长HMIM的保留时间，特别是当与离子液体阴离子如六氟磷酸盐相关时，它对固定相具有很强的亲和力，并吸附静电相TCA至固定相[40]。

  1. 实验
    1. 试剂

在少量乙腈(Scharlab，Barcelona，Spain)中制备约100 g/ mL阿米替林，氯米帕明，多塞平，丙咪嗪，马普替林和去甲替林(均来自Sigma，St.Louis，MO，USA)的储备溶液，并使用Elma（德国Singen）的Elmasonic IT-H超声波浴。 溶液需保持在4℃，并在至少两个月内保持稳定。注射溶液用水稀释至20 g/ mL。尿嘧啶（Acros Organics，Geel，比利时）被用作死时间。

流动相选用乙腈和氯化1-己基-3-甲基咪唑鎓(HMIM·Cl)或1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(HMIM·BF4),三种试剂均来自Sigma。为了比较目的，还制备了不存在IL的流动相。在加入有机溶剂之前，所有流动相用磷酸二氢钠（Fluka，Buchs，瑞士）和盐酸(Scharlab)在pH为3的条件下进行缓冲。

将药物溶液和流动相在验证过程中更新几次，通过0.45 m尼龙膜（Micron Separations，Westboro，MA，USA）过滤，并在超声波浴中脱气。整个过程都使用超纯水（Thermo Scientific，Dubuque，IA，USA）。

    1. 仪器和色谱条件

安捷伦仪器(德国瓦尔德布伦)，配有等距泵(系列1100)。自动收集器(系列1260)。固定在25℃的恒温柱室(系列1260)。紫外可见光波长检测器(系列1100)。用于数据采集的HPChemStation(Agilent，B.04.03)。TCA检测波长为254 nm，马普替林为278 nm。用于数学处理的Excel(MicrosoftOffice 2010，美国华盛顿州雷德蒙德)。色谱峰与Michrom[41]结合，利用该软件对色谱图进行了模拟，并对流动相进行了优化。所使用的Zorbax Eclipse XDB C18和C8(Agilent)柱具有以下特点：150 mmtimes;4.6 mm内径，5 m粒径，180 m2/g表面积，孔径为80碳负荷分别为10%和7.6%。分析柱连接到类似的30 mm防护柱。用C8柱和pH=3缓冲溶液（乙腈体积分数为30%， HMIM·Cl浓度为10 mM）进行药物制剂的推荐分析。流速设定为1 mL/min。

    1. 方法

在这项工作中分析的药物是片剂。每片的平均重量由10个单位的重量计算。 研磨内容物并在研钵中减少成均匀的细粉，取几份粉末并用少量乙腈或30％乙腈/ 10 mM HMIM·Cl（所选流动相）超声处理。流动相也进行稀释。 赋形剂在测定的培养基中不可溶，因此样品溶液必须通过0.45 m尼龙膜过滤，然后注入色谱仪。

  1. 结果与讨论
    1. 实验设计

HMIM阳离子形成的离子液体和对固定相的低亲和力或亲和力的阴离子，如氯化物和四氟硼酸盐，已经表明它们对碱性药物如alpha;-肾上腺素受体拮抗剂具有极好的峰形增强剂，因为它们将较窄的色谱峰与使用传统C18色谱柱保留时间更短[8,40]。然而，一旦达到了柱状饱和度，在添加物浓度增加的情况下，会观察到保留率的最小变化。

鉴于这些结果，最初选择Zorbax Eclipse XDB C18柱（B型，由高纯二氧化硅制成），并将HMIM·Cl和HMIM·BF4以固定浓度(10 mM)加入到乙腈-水流动相中，洗脱TCA。由于固定相上残留的无硅醇基团的质子化作用，流动相在pH 3缓冲以有利于良好的峰形。为了详细了解流动相的组成（乙腈浓度），色谱数据（保留时间和峰宽）对TCA行为变化的影响。基于涉及三个流动相的实验设计数据,覆盖域20至30%乙腈的HMIM·Cl和25至35%乙腈HMIM·BF4的存在。

Time（min） Time（min）

为了比较目的，制备含有30-60％乙腈的不含IL的流动相。选择乙腈和IL的浓度以确保在实际分析时间内溶质的洗脱。在不存在和存在HMIM·Cl和HMIM·BF4的情况下，使用C8色谱柱（也是B型）和乙腈/水混合物进行类似的研究，其中乙腈的浓度如下：25-35％，HMIM·Cl和30 -40%,HMIM·BF4和无IL。使用两个色谱柱（C18和C8）进行20 L重复注射。

通过观察每种化合物的峰的色谱行为所获得的信息，对它们的保留和峰形（峰宽度和不对称性）进行建模。在MICHROM软件的协助下，在研究范围内的任何流动相组合物中含有六种TCA的色谱图谱被预测和优化。

    1. 离子液体对TCA保留率和峰形的影响

图1中b和c显示了用C18色谱柱分析的六种TCA的混合物的模拟色谱图，以及用C8色谱柱获得的图1e和f色谱图。 对于两种色谱柱，流动相均含有30％乙腈和10 mM HMIM·Cl或10 mM HMIM·BF4。为了比较的目的，对于两个柱子描绘了用不含IL的30％乙腈获得的色谱图（图1a和d）。

两个色谱柱的保留时间没有显着差异，C8色谱柱的保留时间稍小（如预期）。 HMIM·Cl加入到水-有机流动相中后，保留率显着降低。对于保留时间最长的TCA，氯米帕明，C18柱的保留时间从34 min降至13.9 min，而C8柱的保留时间从29 min降至12.9 min，这是由于阳离子三氯乙酸与HMIM之间的斥力，后者强吸附在柱子上（氯离子阴离子被弱吸附）。将HMIM·BF4添加到氢化有机流动相中，保留时间更短：C18柱为34 min至23.5 min，氯米帕明C8柱为29 min至20 min，是因为非 TCA对四氟硼酸盐阴离子的吸引力不足。

另一方面，在不存在和存在IL的情况下，在两个柱之间观察到选择性的差异。尽管如此，在所有分析条件下，分辨率并不完全，最佳分辨率对应于不含IL的C18柱（图1a），但分析时间明显更长。因此，去甲色氨酸和马普替林与C18色谱柱无法分离，特别是在IL存在的情况下。马普替林和阿米替林在C8色谱柱上都没有分离，无论是否存在IL和HMIM·Cl。在HMIM·BF4存在下，去甲替林，马普替林和阿米替林的峰与C8柱高度重叠。

正如预期的那样，在两种离子液体存在下的色谱峰几乎是对称的，并且比用氢 - 有机混合物得到的色谱峰窄。 没有IL时，观察到明显的拖尾（图1a和d）。

    1. 固定相和流动相添加剂的选择

在上一节中，结果显示了使用HMIM·Cl分析含有TCA的样品的优势。用C18和C8色谱柱获得的分辨率和分析时间没有显着差异。然而，最后选择C8色谱柱进行这些分析，基于观察到在不同的连续日内甚至在同一天内进行了几次注射，在没有IL和HMIM·Cl和HMIM·BF4存在的情况下，保留时间都增加了，特别是在C18柱上，滞留时间逐渐变化。保留时间的逐渐改变可能对验证过程产生重要影响。应该注意的是，在以前的报告中，肾上腺素受体拮抗剂还没有观察到这种反应。

图2a-c显示了当使用不含IL、HMIM·Cl、HMIM·BF4存在下使用C18柱分析时两种TCA（多塞平和丙咪嗪）的行为。由于它们的高疏水性，TCA似乎积聚在柱头上，由于“过载”效应而增加了保留时间。含有离子液体的流动相的效果更强，特别是当阴离子对固定相的亲和力更大时（四氟硼酸盐的情况）。 正如所评论的，氯化物在烷基键合固定相上吸附很弱，而四氟硼酸盐表现出适度的亲和力[9]，并且静电吸引阳离子溶质到驻点相。

图2d-f显示使用不含IL的C8柱和在HMIM·Cl存在下使增加的保留时间最小化。 HMIM·BF4的过载效应仍然存在，尽管与C18柱相比程度较低。 这些结果表明，用于分析目的的最佳条件应该结合使用C8色谱柱和含有HMIM·Cl作为添加剂的流

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