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在处理生活污水的Carrousel氧化沟系统不同功能区的微生物群落组成
Dong Xu1,2, Sitong Liu2*, Qian Chen1,2 and Jinren Ni1,2,3*
摘要
文章系统地研究了传统Carrousel氧化沟系统厌氧-缺氧-好氧区微生物群落的多样性。从6个完整的WWTPs中采集的活性污泥的监测结果表明，变形菌、绿弯菌、拟杆菌、放线菌、疣微菌、酸杆菌和硝化螺旋菌属占主导地位的菌种，而硝化螺旋菌是这三个生物区中最丰富、最普遍的属。50个最丰富的属在厌氧、缺氧和好氧区中的分布有大致相同的百分比，3个属(即未培养的细菌PeM15、Methanosaeta和Bellilinea)在缺氧区有显著差异。在所有的样品中，Illumina光照高通量的序列与氨氧化生物和反硝化剂有关的是硝化螺旋菌，未培养的亚硝基菌科，脱氯单胞菌，索氏菌，脱硝菌，红环菌(norank)和丛毛单胞菌(norank)。此外，根据蒙特卡洛置换试验分析微生物群落（p＜0.05），水温、水量、进水氨氮、进水化学需氧量（COD）和出水COD等环境变量均表现出显著的相关性。硝化螺旋菌、未培养的硝酸单胞菌和脱硝菌的丰度与COD和铵态氮的影响/出水浓度呈正相关，而脱氯单胞菌、索氏菌、红环菌(norank)和丛毛单胞菌(norank)均与水的体积和温度呈正相关关系。在不同地理位置的6个代表WWTPs的不同生物功能区中，微生物群落与环境变量之间建立的关系，使目前的工作有可能用于评价实际的废水处理过程。
关键词：Carrousel氧化沟，生物功能区，废水处理，微生物群落结构，光照高通量测序。
介绍
氧化沟在废水处理中得到了广泛的应用，特别是在中国的中小型污水处理厂(Zhang et al. 2016)。氧化沟作为一种改性活性污泥法，在结构简单、操作方式灵活、污泥生产效率低、在同一水箱内具有特殊的硝化、脱氮能力等方面具有明显的优势。氧化沟经常被用于同时进行硝化和反硝化，因为在一个通道内的氧和缺氧区域的交替，可以通过调节氧气供应与表面曝气设备或表面曝气结合微孔曝气(Ammary and Radaideh 2005; Liu et al. 2010; Jin et al. 2015; Zhou et al. 2015)。
Carrousel氧化沟系统，通常有一个外部的前厌氧区和一个内部的前缺氧区，是最常用的氧化沟类型之一(Peng et al. 2008;Jin et al . 2014)。在环形通道系统中，Carrousel氧化沟的设计是为了达到反硝化和硝化细菌的优良性能。近几十年来，广泛研究了操作条件(如温度、水力滞留时间、溶解氧和运行方式)、沟槽几何、曝气器设计和曝气方式，优化了处理工艺，提高了脱氮能力(Liu et al. 2010; Saida et al. 2010; Jin et al. 2015)。同时，还开发了模拟水动力学、氧传质、碳氧化、硝化和反硝化过程的数学模型，并对氧化沟中复杂的交替氧和缺氧条件进行了优化。(Saida et al. 2010; Xie et al. 2011; Yang et al. 2013; Lei and Ni 2014)。
作为一种重要的用于废水处理和除氮的微生物介导的方法，Carrousel氧化沟系统的效率和稳定性完全依赖于属于执行硝化、氨氧化和反硝化作用的不同功能的微生物的协同和合成活性(Vanwonterghem et al. 2014; Rodriacute;guez et al. 2015)。近年来，基于微生物16S rRNA的几种分子技术已被用于研究氧化沟系统中的微生物群落结构(Zheng et al. 2015; Xia et al. 2016)。例如，Guo et al. (2013)利用荧光原位杂交(FISH)研究了硝化细菌群落结构。Zhou et al. (2015)通过观察硝化和反硝化细菌的共存，以及利用荧光原位杂交和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳方法，在氧化沟中发现了模拟的硝化和反硝化作用。Jin et al.(2015)通过高通量454焦磷酸测序研究了不同曝气方式对Carrousel氧化沟微生物群落的影响，其中活性污泥样品从缺氧和好氧区取样，混合比例相同。
在本研究中，采用Illumina高通量测序法，揭示了用Carrousel氧化沟系统从6个全尺寸WWTPs中取样的活性污泥的微生物群落潜水员和结构。研究了在Carrousel氧化沟系统中不同功能区中的核心微生物种群和分布的氧化态氮和反硝化剂。在三个生物功能区之间以及在六个不同地理位置的WWTPs之间，对核心微生物的丰富特征进行了评价。更重要的是，建立了微生物群落与环境变量之间的关系，对实际废水处理过程的诊断具有重要意义。
材料和方法
样本收集和测定
研究的6个全尺寸的Carrousel氧化沟系统(均配置了一个外部的前厌氧带和一个内部的前缺氧区)分别在中国不同的地理位置的6个WWTPs上，分别由XJYQ、ZZLQ、HBLY、BJYF、GDHZ和MYYX表示。这些WWTPs的描述显示在附加文件1：表S1。将厌氧-(A1)、缺氧-(A2)和oxic-(O)活性污泥样品分别从Carrousel氧化沟系统相应的生物-逻辑功能区收集。每一个活性污泥样品都是固定在现场，与50%的乙醇(v/v)混合在一起，保存在一个冰盒中，在DNA提取前在实验室里存放于minus;20°C。根据标准分析程序(Clesceri et al. 1998)，测定了WWTPs的影响/流出物中化学需氧量(COD)和氨氮浓度。pH值和DO的水平分别由pH传感器(pHS-25)和DO sensor (WTW Oxi 340i)确定。
DNA提取
根据制造商的协议，从每一个活性污泥样品中提取基因组DNA，使用PowerWater DNA隔离试剂盒(MO BIO, CA, USA)。提取的DNA样本存储在minus;20°C，以供后续分析。在1.5%琼脂糖凝胶电泳中证实了完整的DNA。采用纳米微分光光度法(Thermo Scientific, DE, USA)测定提取DNA的浓度和质量。
聚合酶链反应(PCR)扩增和高通量测序
16S rRNA基因的超变V3-V4区域被从所有DNA提取物中得到扩增，其中包含有条形码引物340F (CCTACGGGNBGCASCAG)和805R (GACTACNVGGGTATCTAATCC)：初始变性在95°C 3min,其次是30周期在95°C 的30s,50°C的 30s和72°C的60s和72°C最终扩展7min的实验室——周期计PCR(Sensoquest,德国)。50micro;L PCR混合物包含5micro;L 10times;缓冲区,38.8micro;L 5 ddH2O,1micro;L核苷酸(10毫米),每个引物2micro;L,0.2micro;L KAPA Taq(美国KAPA生物系统公司)和1micro;L基因组DNA。经1.5%的agarosegel电泳确认后，PCR产物经混合后，通过MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN, Germany)得到每一个样品的DNA片段的平均浓度，然后使用Illu- mina Hiseq2500 PE250平台进行测序。
高通量测序数据分析
所有获得的16S rRNA基因PCR扩增的结果都经过了质量筛选和标记，以去除低质量或不明确的读取。然后将处理后的和反向读取合并到PANDAseq (Masella et al. 2012)。假定嵌合序列在QIIME (Caporaso et al. 2010)中使用USEARCH61 pipe- line (Edgar et al. 2011)进行识别和排除。其余的高质量序列在97%的相似性阈值中，采用UCLUST方法(Edgar 2010)嵌入到QIIME中的中，并将其聚集到操作的分类单元(OTUs)中。每个OTU的代表性序列的分类标识通过Ribosomal Database Project (RDP)分类器与SILVA数据库进行分类(Wang et al. 2007)。从本研究中获得的光照序列的原始数据被存入NCBI序列，并加入了加入编号：No.SRP093686(PRJNA354474)。
统计分析
使用R包对每个样本的前50个属的热图进行了分析。采用开放源码软件细胞景观v3.3.0 (Shannon et al. 2003)进行聚类网络分析，以可视化最不相关的OTUs，并比较它们在不同样本中的丰度。线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)管道(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)(Segata et al . 2011)是用于识别不同的丰富特性在不同生物功能区域的旋转木马系统和不同的抽样WWTPs。不同的特征在OTU水平上是一致的(相对丰度gt;1%)。采用非参数因子秩和检验方法，对具有显著差异丰度的率进行了检测。LDA被用来评估每个差异丰富的性状的影响大小。在Kruskal-Wallis测试的alpha;值下进行LEfSe分析lt;0.05，判别特征的对数LDA评分阈值为gt;2.0 (Zhang et al. 2013)。主成分分析(PCA)采用Canoco 4.5(美国微电脑电源)进行。采用约束排序法，利用R软件与纯素和ggplot2软件包对核心属类和环境变量之间的关系进行分析
结果
Carrousel系统的生物多样性和微生物群落概况
利用16S rRNA基因安培的光照序列，从个体活性污泥样品中获得8017-10681 OTUs。OTUs, Goodrsquo;s coverage，Chao1, ACE, Shannon和Simpson的每个样本可以在额外的文件1:表S2中看到。从164,591光照中提取了48个细菌和7个古菌，从18个仙人掌的污泥样本中提取出有效的序列，而对古菌门的阅读量仅占整个门的1.22%。
每个样本中主要的植物(每一个序列的序列都超过2%，至少有一个WWTP)是由变形菌、绿弯菌、拟杆菌、放线菌、酸杆菌、疣状菌、硝化菌、芽单孢菌、浮霉状菌、菌群、TA06、绿菌、Woesearchaeota (DHVEG-6)和细菌(norank)(图1)。变形菌是最占主导地位的门，占所有门的33.9-50.9%，绿弯菌(12.1–18.8%)，拟杆菌(6.6–20.8%)，放线菌(5.1–11.8%)，疣状菌(1.4–9.4%)，酸杆菌(1.4–6.3%) 和硝化菌(0.8–6.1%)。在变形菌的分布上，beta;-变形菌占总数的13.1–25.1% ，其次是delta;-变形菌(5.2–9.0%)，alpha;-变形菌(5.4–8.4%)，gamma;-变形菌(4.1–9.4%)。
在属级，18个活性污泥样品中鉴定出1594个属。在6个WWTPs中，从厌氧-(A1)、缺氧-(A2)和好氧-(O)区的前50个属的相对丰度如图2所示。前50个属属于11个细菌门(包括硝化菌，变形菌(alpha;-，beta;-，gamma;-，delta;- 和norank)，拟杆菌，芽单孢菌，放线菌，绿弯菌，疣状菌，菌群，后期细菌，TA06和酸杆菌) 和一种古细菌(DHVEG-6)。
在单个样本中，最丰富的属是硝化螺菌属，其相对丰度从0.8到6.1%不等，而另一种则是芽单孢菌科(属芽单胞菌门)，在个体样本中，其含量从1.1到3.6%不等。其他排名前十的丰富的属在所有样本中发现丛毛单胞菌(norank)，索氏菌，未培养的硝化菌，脱氯单胞菌和红环菌属于beta;-变形菌(没有排名)，微丝菌属于放线菌属，OPB35土壤组(没有排名)属于疣状菌属，和氯虫(没有等级和未培养的)属于氯虫门。
图1：在每个WWTP(至少一个WWTP中，序列百分比在2%以上)的主要类群和主要种属的百分比。在左侧的聚类以未加权的UniFrac分析的方式在病例之间提供了基于系统的距离。数字单位:百分比(%)。
铵态氧化剂和反硝化剂的分布
在卡罗塞氧化沟废水处理系统中，发生硝化和反硝化作用，主要是催化氧化细菌(AOB)(氧化氨氧化亚硝酸盐)、硝酸氧化细菌(NOB)(硝酸盐氧化亚硝酸盐)和/或完整的铵氧化剂(Comammox)(硝酸铵完全氧化)和反硝化剂(硝酸盐通过亚硝酸盐和中间气态氮氧化物产品还原为二氮)。Illumina序列与氨氧化生物和厌氧(A1)、缺氧(A2)和好氧(O)活性污泥样品的反硝化剂有关。6个WWTPs如图3所示。硝基螺旋体(包括检测到的念珠菌、硝基螺旋体和其他两种未培养的硝基螺旋体)可以对硝酸盐进行氧化，除XJYQ外，在研究的WWTPs的活性污泥样品中有3%以上的活性污泥样品。亚硝酸菌科(未培养的)作为一组主要的氧化铵对亚硝酸盐的作用，从BJYF、GDHZ和MYYX的WWTPs中占了1.5 - 3.8%。NOB与AOB的比率[即硝化菌/亚硝化菌科(未培养的)从119到687%不等，HBLY和ZZLQ可能会突出高比率的极好的硝化过程(406-687%)。
在所有样本中检测到5个反硝化基团，分别是脱氯单胞菌、索氏菌、脱硝菌、红环菌(norank)和丛毛单胞菌(norank)，其相对丰度为0.2 ~ 4.8%。脱氯单胞菌、索氏菌、脱硝化体、红环菌(norank)属于红环菌属。
PAC显示，每个WWTP的厌氧-(A1)、缺氧(A2)和好氧(O)区的样品都是聚集在一起的，但不同的WWTPs(图3b)中，铵氧化剂和反硝化剂的相对丰度明显不同(图3b)。在6个WWTPs中，BJYF中氮素转化最相关的丰富属是脱氯单胞菌(3.1-3.8%)，亚硝酸单胞菌科(未培养)(2.7-3.8%)和脱硝化体 (1.8%)， XJYQ为索氏菌(2.9-4.8%)，丛毛单胞菌(norank)(3.7-4.3%)，在ZZLQ和GDHZ中分别表现为硝酸螺旋体(4.8-6.1%)和红环菌(norank)(2.5-3.4%)。在6个WWTPs中，XJYQ的相对丰度是最高的，而MYYX是最低的。污水水质和环境因素的差异可能导致WWTPs中细菌数量的差异。
图2：在每个WWTP中，热图描绘了厌氧区(A1
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