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在序批式反应器中以葡萄糖作为独立碳源以达到增强除磷效果的测试
作者：CHE OK JEON和JONG MOON PARK
（韩国浦项科技大学，环境工程学院环境生物实验室；初版1998年10月1日，修订版1999年8月1日）
摘要：此次测试以葡萄糖为唯一碳源，研究了其在厌氧/好氧序批式反应器（SBR）中用以增强生物除磷（EBPR）代谢的影响。有报道声称，由于所谓的“G-细菌”在厌氧条件下不积聚多磷酸盐并不吸收正磷酸盐的原因，不能用葡萄糖饲料作为碳源来实现增强生物除磷（EBPR）的目的 。 然而不同于以往的报道，在我们的测试中，使用葡萄糖作为唯一碳源仍可实现增强生物除磷的目的。
在测试中出现的葡萄糖消失和糖原积累迅速生成现象，这与其他报道一致。但正磷酸盐的释放和聚3-羟基链烷酸（PHAs）的合成是与，总有机碳（TOC）的浓度而不是葡萄糖浓度有关。通过在13C-NMR光谱追踪，在厌氧阶段开始时供应的所有13C-标记的葡萄糖，来研究在厌氧/好氧条件下葡萄糖的作用。结果表明，在完成EBPR的细菌供给过程中，至少由两种微生物群体产生作用，一种是乳酸生产有机体（LPO），另一种是聚磷酸盐积累有机体（PAO）。在厌氧阶段PH6.9环境下释放0.12 Pmmol的磷酸盐时，约有1 C-mmol的葡萄糖合成约0.42-mmol mmol的芳香烃。 磷酸盐释放量与pH值成正比。除了PAO产生的PHAS之外，PHO还通过LPO将葡萄糖转化成另一种储存化合物（推断为乳酸聚合物），所以合成的PHA的量少于加入的葡萄糖的量。在好氧阶段，细胞中的PHA和储存化合物被代谢并发生磷酸盐摄取。在这项工作中，在葡萄糖作为唯一碳源的SBR中提出了PHA合成和除磷的可能代谢途径。
关键词：强化生物除磷、序批式反应器、代谢途径、葡萄糖、聚羟基链烷酸
最近富营养化已成为全球最重要的水质问题之一。在水中的许多营养物质中，含磷化合物已被证明为是导致富营养化的主要原因。在许多除磷方法中，生物系统被认为是最有效的终极方法，而在除磷的实际操作中被广泛适用。自从关于能够积聚过量多磷酸盐的生物体首次报道（Shrinath等人，1959年）以来，已经进行了许多关于除磷过程的实验研究，目的是威力更好的理解增强生物除磷（EBPR）机制并实现稳定和有效的生物学。尽管付出种种努力，但由于其复杂性，EBPR的确切机制尚未被合理的解释。
为了诱导EBPR活性，需要在厌氧和好氧或缺氧条件之间进行选择。通常，负责EBPR的微生物（多磷酸盐（Poly-P）细菌）能够储存作为内部储存化合物（聚3-羟基链烷酸[PHA]）的有机化合物（短链挥发性脂肪酸[SCVFA]）和利用在厌氧条件下多磷酸盐降解为正磷酸盐所产生的能量。在外部碳底物不存在的随后有氧条件下，细菌使用储存的底物产生能量用于细胞生长和维持以及正磷酸盐的摄取从散装液体到聚磷酸盐。虽然截至目前已经提出过多种生物化学模型（Comeau等，1987; Wentzel等，1986; Mino等，1987）用来解释EBPR机制，但仍存在一些争议。这些模型都认为SCVFA（特别是乙酸盐）在EBPR机制中作为底物发挥了关键的作用。
现在普遍认为，在EBPR系统中聚-P微生物是无法在厌氧条件下直接利用葡萄糖的，此外，葡萄糖甚至不利于EBPR，除非它首先被非polyP微生物（产酸细菌）转化为SCVFAs， （Randall等，1994）。Cech和Hartman（1990）报道了当醋酸盐和葡萄糖作为碳底物供给时，由于“G-细菌”的生长反而会导致的EBPR分解。他们通过以下事实解释了细菌的分解：当细菌含有葡萄糖时，G细菌主导厌氧/好氧过程，在有氧条件下不会积聚多聚磷酸盐，并且能够在厌氧条件下吸收葡萄糖而不释放磷酸盐（Cech和Hartman，1993; Satoh等，1994）。因此，PHA可以在没有能量消耗的情况下进行合成，但是在这些G细菌中净产生1摩尔的ATP。因此，由于多磷酸盐对它们不是必需的，所以G-细菌可以在厌氧/好氧系统中底物的竞争中取胜聚-P细菌。Mino等人（1994）提出了一种支持G细菌分解EBPR的代谢模型。
另一方面，Tracy和Flammino（1987）提出，当葡萄糖作为糖原储存在厌氧条件下时，可以通过多磷酸盐的水解释放出正磷酸盐。储存的糖原在需氧条件下通过EMP途径和TCA循环进行代谢。产生的过量ATP可被聚-P微生物用于合成细胞物质和聚磷酸盐。Nakamuraetal（1991）报道，当葡萄糖和蛋白胨被用作碳源时，Microlunatus phosphovorus可以在厌氧条件下释放正磷酸盐并且在有氧相中积累多磷酸盐。Carucci等人（1994）也报道，当提供葡萄糖和蛋白胨的混合物作为碳底物时，在厌氧/好氧序批式反应器（SBR）系统中达到了良好的除磷效率，但在正磷酸盐的厌氧释放期间并未检测到PHA或其他产物，并且葡萄糖的减少与正磷酸盐的释放没有关联。但也尚未有提出代谢途径或提供葡萄糖作为唯一碳源的EBPR机制的报道。核磁共振技术实现了对代谢途径的研究可以通过非侵入性途径实现。通过13C-NMR可沿着代谢途径追踪13C同位素标记的代谢物的特异性原子（只有1.10％天然丰富）。在这项工作中，我们应用这种13C-NMR来研究，葡萄糖在用于EBPR的SBR系统的厌氧/好氧条件下的作用，并建议作用到当葡萄糖作为唯一碳源供应时的EBPR代谢模型中。
材料和方法
SBR操作过程：
接种物种子从POSTECH校园内的活性污泥处理厂获得。 实验中使用的浓缩合成废水由有机和矿物溶液组成。 每升的有机溶液的成分包括1125mg葡萄糖和1.1252ml 1NNaOH溶液。营养液包括：0.3057g的NH4Cl，0.1318g的KH2 PO4，0.0696g的MgCl2，0.02114g的CaCl2，0.002g酵母提取物和1.4ml的NH2SO4，在1升蒸馏水中的0.6ml微量元素混合物。微量元素混合物由1升蒸馏水中的0.90044克FeCl3,0.15克H3BO3,0.03克CuSO4.5H2O，0.18克KI，0.06克MnCl2·4H2O，0.12克ZnSO4.7H2O，0.15克CoCl2·7H2O，0.06克Na2MoO42H2O和10克EDTA组成。COD（化学需氧量），NH 3-N和PO34yuml;-P在SBR中的装载量分别为600,40和15mg / l。
一个工作容积为4升的全抽吸序批式反应器（SBR）系统以8小时循环时间运行。每个循环包含填充过程15分钟，厌氧过程2小时，好氧过程4小时20分钟，沉降过程60分钟，抽出过程15分钟和空闲阶段10分钟。在沉降阶段结束时从反应器中取出2L的澄清的上清液，并在溶解阶段将1L有机和营养溶液泵入反应器中。通过在好氧阶段结束时从反应器中取出污泥来将平均细胞停留时间（污泥龄）控制在约10天。在厌氧阶段，通过在搅拌下鼓泡氮气使反应器保持在厌氧过程中。用定时器控制微管油泵，空气泵，氮气供应和搅拌器装置。根据循环过程，将pH控制在6.9plusmn;8.0的范围内。使用水循环系统将温度控制在258℃。
批量实验：
使用从上述葡萄糖供给的SBR操作中抽取的污泥进行补充分批培养，用以研究微生物的详细代谢过程。 批量实验使用带有500ml工作体积的夹套玻璃容器。 在整个实验过程中控制温度（258℃），pH（6.9）和混合（150rpm），并使用氮气吹扫装置维持厌氧条件。通过离心法（1000g，5分钟，48℃）在需氧阶段结束时从SBR排出的400ml活性污泥浓缩并重新悬浮于200ml不含葡萄糖的新鲜矿物质溶液（pH 6.9）中。然后加入200ml葡萄糖溶液（562.5mg / l）开始厌氧试验。硝酸盐在间歇培养初期不存在。
在添加葡萄糖之前将碘代乙酸酯（一种选择性糖酵解抑制剂）加入到间歇式反应器中，以便更详细地研究多磷酸盐对糖原储存的厌氧葡萄糖代谢和能量供应。 碘乙酸盐的浓度为1 mM。 在另一批次培养过程中，使用L-乳酸（100mg / l）代替葡萄糖来研究聚磷酸盐积累生物体（PAO）的代谢。为了研究产乳酸生物体（LPO）的代谢，在厌氧分批培养10分钟后将污泥从玻璃容器中取出，并离心除去由LPO产生的乳酸盐。 将离心后的污泥再悬浮于400ml新鲜的半强度矿物溶液中，并在氮气吹扫以除去氧气后重新开始厌氧操作。使用13C6标记的D-葡萄糖（99原子％，Sigma-Aldrich）溶液（581.25mg / l）追踪13C-NMR厌氧分批培养期间的葡萄糖的作用。
分析：
立即通过Watmann GF / C玻璃微滤器（1.2mm孔径），从SBR中进行活性污泥取样，并在1008℃干燥5小时以测量混合液悬浮固体（MLSS）的浓度。 为了分析细胞糖原，PHA和体内核磁共振，立即将几滴1N硫酸溶液加入污泥样品中以停止细菌活性。 将污泥样品通过Whatman GF / C玻璃微滤器过滤并完全冻干。使用DX-120离子色谱仪（Dionex，美国）分析溶液中的NO3 -N，NO 2 -N和PO343 -P的浓度，并且使用TOC分析仪（Shimadzu TOC-500，日本）测量总有机碳（TOC）。
为了分析细胞中的PHA，按照Comeau等人的方法消化冻干的污泥样品，甲基化并用氯仿萃取。（1988）。使用配有SUPELCO蜡柱（长30m，内径0.25mm，厚度1.0mm）的气相色谱系统（Hewlett Packard 6890，USA），一个离子化检测器和一个自动采样器。 使用氦气作为载气（30cm / s）和补充气体。 用FISON 8000系列和Platform II（Micromass，UK）进行结构确认和PHA起源的GC / MS分析。
在其他所述的进行糖原分析（Smolders等，1994; Brdjannovic等，1998）过程中。 将冻干的污泥样品在0.6N HCl水溶液中于1008℃条件下消化1小时。 在冷却和过滤后，使用具有CarboPac PA1柱（Dionex）的HPLC（Dionex，USA），0.1N NaOH水溶液作为洗脱液和脉冲安培检测器进行适当稀释后分析细胞。 还使用与糖原分析相同的HPLC系统和操作条件分析溶液中的葡萄糖。
13C-NMR光谱的采集
使用在75MHz下运行的Bruker AMX300光谱仪中的四重核酸探针头（5mm直径）获得13 C-NMR光谱。为了获得上清液的13 C-NMR光谱，加入D 2 O（5％）作为信号储存器并且将13 C标记的甲酸（1.3823mg-C / l当量）作为内标。为了获得细胞的13 C-NMR谱，将冻干细胞悬浮于含有13 C-标记的甲酸的D 2 O.每个样品的数据采集时间约8小时。
图1 在长期运行SBR（▲：正磷酸盐；△：硝酸盐）的磷酸盐和硝酸酯的典型周期。
SBR长期运行过程中磷酸盐和硝酸盐的典型循环（R：邻磷酸盐; r：硝酸盐）。
随着SBR操作的持续，葡萄糖摄取率增加，并且最终在90天内达到高生物强化除磷效果（EBPR）;几乎立即被微生物吸收。
图1显示了在建立EBPR（116天）后，典型的SBR循环中的磷酸盐和硝酸盐。其他重要化合物如总有机碳（TOC），PHA（3-羟基丁酸[3HB]，3-羟基戊酸[3HV]，3-羟基-2-甲基丁酸[3H 2MB]，和3-羟基-2-甲基戊酸[3H2MV]）和糖原如图2所示。细胞中糖原和PHA含量的变化以及该葡萄糖供给的SBR中的磷酸盐释放量远小于其他SBR供应的醋酸盐作为碳源，循环模式也不同（醋酸盐进料的SBR数据未显示）。在该SBR中，3HV单位是构成PHA的主要单位（摩尔百分比，3HB：3HV：3H2MB：3H2MV = 23.35：60.05：6.39：10.21），而PHA主要由乙酸中的3HB单元组成（按摩尔百分比计，3HB：3HV：3H2MB：3H2MV = 84.04：12.68：2.40：0.88）。
图2 在喂以葡萄糖作为唯一碳源的长期运行过程中，TOC、PHAs、糖原分布的典型周期（Q：糖原；R：TOC；R：PHAs）。
细胞中糖原变化的模式也彼此不同。在醋酸进料SBR中操作中，细胞中糖原的量在厌氧阶段下降并在好氧阶段增加（图3），
这与Mino等报道的模型一致（1987）解释了通过在好氧阶段储存的细胞内糖原的降解来提供PHA合成所需的还原能力。 在葡萄糖喂养的SBR中，糖原在厌氧阶段早期迅速增加并逐渐减少。 在随后的好氧阶段，细胞中糖原的量没有改变。
结果
SBR的长期运行
供应葡萄糖作为唯一碳源的SBR的长期操作持续250天。磷酸盐释放和去除效率随着时间逐渐增加。大约70plusmn;80天后，磷酸盐去除效率几乎达到100％。在SBR运行的早期阶段，葡萄糖仍然保持到厌氧阶段结束。
在葡萄糖喂养的SBR中，在SBR的本体溶液中未检测到葡萄糖，因为它在喂食后几乎立即消失。 然而，葡萄糖的消失并不与磷酸盐的释放和PHA的合成相一致。 在厌氧阶段，观察到pH下降，这与Carucci等报道的结果相似。（1994）。 通过GC和HPLC分析在本体溶液中未检测到短链挥发性脂肪酸（SCVFAs），发酵产物。
EBPR在分批培养中的代谢
为了研究EBPR的详细代谢，在开始时使用SBR的活性污泥一次添加葡萄糖进行分批培养。由于除去硝酸盐以消除消耗碳底物的反硝化反应，所以输入的葡萄糖仅用于去除磷。因此，可以更精确地研究葡萄糖和磷之间的化学计量关系以及除磷动力学。
如图4所示，葡萄糖在15分钟内完全耗尽，但大
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