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阔叶落叶常绿乔木林地土壤纤维素分解菌的群落组成和纤维素酶活性
摘要
森林土壤中的纤维素分解菌通过分解纤维素残余物提供碳源来提高土壤肥力，维持森林生态系统的营养平衡。这些细菌也可用于将生物质转化为可再生生物燃料。在这项研究中，通过限制性片段长度多态性（RFLP）和16S rRNA基因的测序分析，解决了在中国武汉种植阔叶落叶林（常青花园）和阔叶常绿树（森林公园）的土壤中的纤维素分解菌的群落组成和活性问题。所有分离株均显示35个RFLP指纹图谱，并以50％的相似性水平聚类为六组。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，这些RFLP组可以聚为三个系统发育组，并以更高的分辨率进一步分成六个亚组。组I由来自蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌复合体（I-A）和来自枯草芽孢杆菌的分离物组成，并且在所有的纤维素分解菌分离株中显示出最高的纤维素酶活性。簇II由砖红色微杆菌的分离物、吲哚丁酸杆菌（II-B）、果胶黄杆菌和相关复合物（II-C）组成。簇III由属于恶臭假单胞菌相关物种的分离物组成。社区在植物种类和土壤性质方面的变化可以从社区的系统发育构成中得到证实。在常青花园中，I-A和I-B组占纤维素分解群体的36.0％，而在森林公园中，它们是占优势的群体，占比达到88.4%。属于组III（恶臭假单胞菌相关分离株）的细菌的比例从常青花园中的28.0％变为森林公园中的4.0％。土壤养分分析表明，种植落叶阔叶树的常青花园种植的有机养分（总有机碳和总氮）比种植常绿阔叶树的森林公园种植更丰富。在此背景下，常青花园位点的纤维素分解细菌的种群密度和多样性明显高于森林公园位点，后者以高纤维素酶活性的芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属相关细菌为主。典型相关分析进一步表明，这些组的分布与森林公园位点相关，而组II和III与有机营养丰富的常青花园位点相关。
关键词：纤维素酶，细菌，16S rRNA基因，组成，森林
介绍
纤维素是植物纤维结构的主要组成部分。在森林中，纤维素的分解为改善土壤性质和肥力提供了碳源，并维持了森林生态系统的营养平衡。纤维素材料，包括林业和农业残余物，是最丰富且可用的生物质资源。这些纤维素材料可以水解成糖，然后发酵成乙醇。纤维素乙醇和其他基于纤维素的生物燃料是减少环境污染和保证能源的重要替代能源。然而，在环境恢复和传统的与纤维素乙醇生成有关的转化过程中，纤维素分解废物的异质性使水解过程变得困难。
微生物，特别是普遍存在于土壤中的纤维素分解细菌，在土壤生态系统中植物残体的分解中起着关键作用。由这些土壤微生物分泌的纤维素分解酶也可将纤维素生物质有效地转化为可发酵的糖。与化学转化相比，纤维素酶介导的转化过程被认为是一种绿色环保技术。尽管几种类型的纤维素降解真菌和细菌的纤维素降解酶系统已经被解决，但是关于组成和活性的系统研究纤维素分解群落仍然不够。纤维素酶基因家族具有巨大的异质性和多样性，这使得微生物生态学中广泛采用的方法，如基于通用引物的扩增子或原位杂交，是不切实际的。目前关于纤维素分解细菌的功能多样性和系统发育的研究通常仍然基于纯培养物。
已发表的关于土壤细菌群落的纤维素分解潜力的研究表明，土壤细菌纤维素酶通常是异质的，并且我们可以通过土壤理化参数来控制它们种群密度的分类和分布。植物残体的类型也可以引起纤维素分解菌的优势变化。在森林生态学中，研究分解能力和细胞溶解细菌的作用，是一个传统的研究课题。此外，虽然已经进行了亚热带森林环境与特有生物群和原始森林土壤的纤维素分解菌株的多样性和活性研究，但我们对在阔叶树种植的开发性森林土壤中，纤维素分解菌的群落组成和降解活性的认识仍然不完全。
在本研究中，通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析和测序解决了两个森林地点的土壤纤维素分解菌群的组成，即种植阔叶落叶树的森林和种植常绿阔叶树的森林的16S rRNA基因，还测量了分离物的纤维素分解活性以检查系统发育分配和功能能力之间的相互关系。进行对应分析以确定土壤性质和植物类型是否同样决定了纤维素分解活性和系统发育多样性。在此分离的纤维素降解细菌研究也可以用作纤维素生物质能量转化的资源的研究。
材料和方法
采样点，土壤采样和性质分析
选择位于中国武汉市北部和东南部的长青花园（114°14#39;E，30°38#39;N）和森林公园（114°26#39;E，30°30#39;N）作为在这项研究中的抽样位点。常青花园有种植阔叶落叶树20年的森林，中国白杨是该森林的主要树种。森林公园有15年的森林，种植常绿阔叶乔木，主要树种有莲子玉兰和樟树。从每个森林中的离散位置收集五个土壤样品， 2012年4月18日在枯枝落叶层下方0至5厘米处收集土壤样品。将样品置于清洁无菌塑料袋中，取样后3小时内送入实验室冰块中，并在4℃下保存以获得细菌数量计数和纤维素分解细菌分离，然后储存在-80°C的条件下。
从常青花园和森林公园站点收集的土壤样品被确定为潮土粘土和黄棕壤。使用pH计在土壤泥浆中测量土壤pH。使用凯氏定氮法测量土壤样品的总氮浓度。通过重铬酸钾氧化分光光度法测定沉积物的总有机碳。采用钼钼酸铵分光光度法测定沉积物中的总磷。
土壤细菌计数和纤维素分解细菌分离
将10克新鲜土壤用3％（最终浓度）甲醛固定，用一级超纯水稀释至100g体积的10g土壤浓度，然后在室温下旋转15分钟获得均匀的悬浮液。 1微升悬浮液用4#39;，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，在荧光显微镜下计数细菌细胞。
为了细菌分离，将10g新鲜土壤均质化并悬浮于90毫升含有0.9％NaCl的无菌水中;然后将该混合物连续稀释10倍。从每个稀释液中，将100-mu;L悬浮液等分并在固体培养基（10克蛋白胨，10克酵母提取物，5克氯化钠，1克磷酸氢二钾，1克硫酸镁和每升15克琼脂），然后在25℃条件下温育3至7天，使用最可能数目方法计数可培养细菌的数量。
为了分离纤维素分解菌，将所有菌落加入含有羧甲基纤维素的培养基板（2克磷酸氢二钾，1.4克硫酸铵，0.3克硫酸镁，0.3克氯化钙，5毫克的硫酸亚铁，1.6毫克的四水硫酸锰，10克的羧甲基纤维素钠和15g的琼脂）和含微晶纤维素的培养基板（2克磷酸氢二钾，1.4克硫酸铵，0.3g 硫酸镁 ，0.3g 氯化钙，5mg硫酸亚铁，1.6mg 硫酸锰，10g微晶纤维素和15g琼脂）中，随后在28℃条件下孵育2天，然后进行纤维素分解活性测定，使用刚果红染料（1mg / mL）方法，主要基于Teather和Wood描述的方法进行。羧甲基纤维素或微晶纤维素降解通过集落周围的裂解区来指示，选择分离物用于进一步研究（图1）。
图1在刚果红琼脂平板上的分离株的表型。 以CMC-Na作为唯一碳源的平板。 b以微晶纤维素为唯一碳源的板
发酵和纤维素酶活性测定
将50毫升发酵培养基（每升5克羧甲基纤维素钠，5克蛋白胨，1克酵母提取物，0.5克硫酸镁和1克磷酸氢二钾（pH6.0））转移到单独的250毫升挡板烧瓶中并高压灭菌。将烧瓶接种1mL含有1.0times;106个细胞的接种物，并在轨道振荡培养箱中于28℃发酵96小时。发酵肉汤的纤维素酶活性以不同的间隔测定。
使用滤纸作为底物测量森林公园中滤纸纤维素酶的活性。将1mL稀释的酶在0.05M柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）和50.0毫克滤纸中于50℃温育30min，然后使用二硝基水杨酸方法。一个单位的滤纸纤维素酶活性定义为在测定条件下每分钟释放1mu;mol还原糖所需的酶量。
细菌总DNA提取和16S rRNA基因RFLP分析和测序
根据细胞的生长速度将细菌在液体培养基中培养24-48小时，然后收集细胞并使用TIANamp Bacteria DNA试剂盒进行基因组DNA提取。用Nanodrop装置分析DNA的质量和数量。使用引物组27F（5#39;-AGAGTTTGA TCCTGGCTCA-3#39;）和1492R（5#39;-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3#39;）（Lane 1991）来扩增热循环仪中的16S rRNA基因片段（asymp;1,450bp）。扩增条件如下：94℃初始变性5分钟; 28个循环，94℃40秒，53℃40秒，72℃80秒;最后在72℃延伸6分钟。
用限制性核酸内切酶HhaI和MobI消化10mu;L等份的PCR产物。每个20mu;L反应混合物含有1times;缓冲液，200 ng PCR产物和1 U酶。在37℃下消化8小时后，在80mV的2％（w / v）琼脂糖凝胶上电泳分离DNA片段大约1.5小时。将凝胶在1mg / L溴化乙锭的水溶液中染色，并在凝胶图像系统的UV照射下拍照。代表性菌株的16S rRNA基因PCR产物用凝胶提取试剂盒纯化，然后使用ABI 3730自动测序仪和1492R引物。本研究获得的16S rRNA基因序列保藏于DNA序列数据库，登录号为KC767855至KC767889。
聚类，多样性和系统发育分析
每种菌株的16S rRNA基因RFLP指纹通过二元评分系统转化为二维二元基质（1表示存在条带，0表示无条带），然后评估菌株之间的相似性具有简单的匹配系数。使用NTSYS软件包根据使用算术平均值算法的未加权配对组方法从距离矩阵构建树状图。 PHYLIP软件包用于比对16S rRNA基因的序列并进行系统发育分析。通过CCA使用Canoco软件（版本4.5，Microcomputer Power，USA）评估细菌群落与环境参数之间的相关性。
结果
土壤性质和细菌数量
常青花园和森林公园的土壤类型分别属于潮土和黄棕壤。根据这些土壤样品的营养分析，常青花园土壤的TOC（108.4 mg / g）和TN（8.6 mg / g）含量高于TOC（64.6 mg / g）和TN（5.7 mg / g）森林公园土壤的含量。相比之下，森林公园位点TP（TP = 1.46 mg / g）略高于常青花园位点TP（TP = 1.24 mg / g）。从常青花园和森林公园站点获得的土壤的pH值分别为6.5和5.5。
使用DAPI染色方法计算土壤样品中的细菌细胞总数（图2）。如所揭示，16S rRNA基因RFLP群落的纤维素分解菌从细菌基因组扩增长度接近1,450bp的16S rRNA基因片段。酶解消化后，通过二元评分系统将分离物的RFLP指纹转移至相似性矩阵。使用非加权组平均法（图3（A，B））基于构建的矩阵描绘每个站点的树状图。来自这两种森林土壤的纤维素分解物表现出丰富的多样性，并且所有的分离物显示35种RFLP指纹图案。如树状图所示，常青花园社区包含20个RFLP指纹模式，森林公园社区包含15个RFLP指纹模式。在相似性水平为50％时，来自常青花园的分离物大致分为五组（C-I至C-V），并且将来自森林公园的分离物聚类为四组（F-1至F-IV）。 C-I，C-II和C-V组含有常青花园位点的大部分群落：分别为本地纤维素分解菌群的36.0％，22.0％和28％。相反，C-III组和C-IV组分别占社区的8％和6％。在森林公园站点中，FI是占优势的群体，该群体占整个社区的62.8％，而F-II，F-III和F-IV群体占整个社区的25.6％，6.0％和4.0％ （图3（B））。结合两个位点的所有代表性RFLP模式的整个树状图显示所有的分离菌可以分成六个簇（I到VI）。在该树中，来自常青花园的C-I组和来自森林公园的F-I组合并且合并为组I.另外，C-II和F-III组合并成为III组，并且C-V和F-IV组合并成组VI。与此相反，F-II，C-III和C-IV组分别在这棵完整的树中分别被分为II，IV和V组（图3（C））。
图2长青花园（CQG）和森林公园（FP）森林土壤样品的细菌数量。 使用DAPI方法计数细菌。 b使用MPN方法计数的细菌和基于菌落周围的裂解区计数的纤维素分解菌
图3由UPGMA算法分组的纤维素分解菌的16S rRNA基因RFLP图谱产生的树状图。
（A）从长青花园分离的细菌。 （B）从森林公园分离的细菌。 （C）通过组合来自两个位点的所有细菌构建的树状图。 括号中显示具有相同16S rRNA基因RFLP基因型的菌株数目。 饼图显示了当地纤维素分解菌群中每个RFLP组的比例
系统发育和社区分类
基于分离的纤维素降解菌的16S rRNA基因序列和参考文献，构建了一个邻接树，以揭示它们的进化距离及其系统发育关系（图4）。与RFLP指纹的聚类分析一致，所有分离物大致分为三组（I，II和III）。第一组含有两个位点的大部分细菌，占细菌总数的60.2％。这个簇可以进一步分成两个子组，分别表示为I-A和I-B。系统发育分析表明，该簇中的分离物与芽孢杆菌属（I-A）和类芽孢杆菌属（I-B）相关。该组占常青花园位点的纤维素分离物的36.0％，而来自森林公园位点的分离物中有88.4％属于该组。更详细的分析表明，I-A亚群可归因于蜡状芽孢杆菌复合物，单纯芽孢杆菌复合物和枯草芽孢杆菌复合物，而I-B亚群可归因于解淀粉芽孢杆菌和相关复合物。第二组占全部细菌群落的22.5％。该组可进一步分为三个亚组（II-A，II-B和II-C）。代表性分离株C5-3-6和C5-2分为II-A和II-B亚群，分别与微杆菌和吲哚丁酸杆菌发生系统发生关系。相反，亚组II-C与果胶黄杆菌和相关复合物有关。虽然第二组只占森林公园站点纤维素分解群落的4.7％，但它包含了常青花园站点的大多数社区（42.0％）。在这两个位点的纤维素分解菌群落中占17.2％的第三组在系统发育上与恶臭假单胞菌和相关物种有关。
图4根据16S rRNA基因的比对序列，从长青花园和森林公园分离的代表性纤维素分解菌的系统
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