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产聚羟基脂肪酸酯混合培养物的富集：pH， N和P的影响
摘 要
聚羟基链烷酸酯（PHA）是可以替代传统塑料的生物聚合物。 本文利用序批式反应器(SBR)，研究了以乙酸为唯一碳源在Feast/famine模式和不同pH下产聚基烷酸酯(PHAs)混合微生物培养(MMC)的富集效果。富集步骤在7.5的受控pH下进行评估（平均值为9.0）。 在实验期结束时两种富集物的乙酸吸收速率表现出相似的行为，大约为0.18Cmol Ac cmol Xminus;1hminus;1和0.19 Cmol Ac Cmol Xminus;1hminus;1 ）分别用于SBR-A和SBR-B。 然而，没有pH控制下富集的生物质的PHA储存容量更好，其具有的最大PHA含量为36％（gPHA gminus;1VSS）,对应的PHA生产速率为0.16 PHA Cmol X minus;1hminus;1。 进行批次实验以评估富集的培养物在不同pH和营养物浓度下的PHA储存能力。 在pH实验中（没有营养限制），发现在没有控制pH的情况下，富集的生物质显示具有-qS和PHA的44％gPHA gminus;1VSS的PHA含量与底物产量（Y PHA / AC）分别为0.57 Cmol Ac Cmol Xminus;1hminus;1和0.33 Cmol PHA Cmol Acminus;1。 关于可变营养盐浓度（pH范围在8.8至9.2）的实验，结果表明，在氮源限制下，富集的生物质中的PHA含量显着高于约51％gPHA gminus;1VSS。 这项工作证明了在没有pH控制的情况下富集具有PHA存储能力的MMC的可行性。 此外，在不控制积累阶段pH的情况下，PHAs含量和底物吸收速率较好。 最后，这项工作也突出了积累阶段中营养物浓度作用的重要性。
1. 介绍
聚羟基链烷酸酯（PHA）代表一组生物聚合物，可以通过几种细菌积累为碳源和能源。 它们的热塑性能与石油基塑料的热塑性能相当，可转化为克服当前塑料市场环境问题的潜在替代物。PHA研究吸引了越来越多的人了解和改进他们的生产技术。 目前，大多数PHA工业生产是通过使用需要无菌条件和使用特定碳源的纯培养或重组培养来实现的，这导致高于常规塑料生产的4-9倍的高操作成本。此外，最终PHA生产成本受到回收过程的强烈影响，因此必须努力改善生物质的生物聚合物含量（影响回收过程的效率），并开发新的回收方法。
使用混合微生物培养物（MMC）是一种令人关注的替代方法，以降低当前的PHA生产成本; 活性污泥是一种众所周知的MMC，能够在非稳定条件下积累PHA。 与纯培养物生产PHA相反，MMC的使用将降低成本，因为需要更简单的控制过程，不需要无菌条件，而且MMC可以很容易地适应碳源变化，因此各种底物可用于此目的。 使用MMC的PHA生产的整个过程通常通过三个步骤来完成。 第一步，通过产酸发酵将有机物转化为丰富的挥发性脂肪酸（VFA）原料。 其次，需要培养富集步骤来选择使用先前产生的VFA来存储PHA的细菌。 最后，收获富集的生物质并且在第三步中使用，其中应用了某些操作条件，主要目的是使生物质中的聚合物含量最大化。
为了实现MMC中的PHA积累，必须在培养物选择步骤中施加特定的选择压力，例如通过应用间歇进水方式或通过改变电子受体的可用性。众所周知的方法是使用饥荒/盛宴机制，其中包括交替短期的C源可用性和长期可用性。在这种条件下，由于它们比其他微生物具有竞争优势，只有能够储存PHA的微生物才能经受饥饿期。
PHA生产的代谢过程通常受某些参数变化的影响，例如：碳源的浓度和类型，营养物可利用性，温度，pH和电子受体可用性等等。PH是影响PHA产量的主要因素之一。然而，研究pH对MMC有氧PHA生产过程的影响是矛盾的。例如，建议PHA生产和细胞生长的pH范围为6.0-7.5。而默罕和雷迪（2013）得出结论，中性pH值会更好，因为参与PHA生产的酶在pH为7时是有活性的。相反，其他研究报道PHA含量在8.0-9.0的pH范围更高（2003; 刘等人，2011; Seram等人，2004; 比亚诺 等人，2010)。
在pH中，必须考虑其他决定性因素以实现富集生物质的更高PHA含量。 如前所述，营养素含量（主要是磷（P）和氮（N））是一个重要的参数，需要考虑（Silva等，2016）作为优化PHA积累的一种方式。在文献中提出，当存在过量的营养物时，碳源用于生物量生长而不是用于PHA积累，。相反，在N和/或P限制下，可以促进PHA积累的代谢途径。在大多数情况下，较高的PHA含量和积累产量在N限制下N过量条件下。 然而，当在非限制性的N水平下工作时，建议PHA特定的储存速率和生产率得到改善。 关于P-限制，它抑制了有利于PHA积累的克雷布斯循环。 尽管如此得出的结论是，当增加养分浓度时，PHA含量没有改善。 因此，似乎不是用特定的N和/或P极限浓度工作，必须找到这些营养素的适当水平才能达到高PHA储存能力。 根据Fang等人，使用活性污泥影响总PHA产生速率的参数的优先权优先级如下：pH NN浓度NP浓度N C源（按化学需氧量-COD-）浓度。 因此，在这项研究中，一方面选择pH效应来首先评估，因为不存在pH控制将导致稳健且更具成本效益的过程。 另一方面，考虑到可以使用不同类型的废水，研究营养物质浓度的影响必须在改善整体PHA生产过程。
为了评估MMC用于PHA生产的可行性，在饥荒/盛宴机制下浓缩来自市政污水处理厂的活性污泥以评估在该步骤中pH的影响。 因此，为了评估富集的生物质的PHA积累能力，进行间歇实验，将pH条件从4.0变化到8.5，并且也在游离pH（从8.8变化到9.2）下进行。 此外，还在不同营养条件下从饥饿到过量的情况下进行了批次实验。
2. 材料和方法
2.1. 生物质浓缩
使用工作体积为15L（SBR-A）和20L（SBR-B）的两个测序批式反应器（SBR）进行生物聚合物生产细菌培养物的选择和维护。 反应器在室温（约22-24℃）下操作，作为未灭菌的MMC在FF方式下12小时循环。 每个循环由以下阶段组成：闲置（12分钟），进水（3分钟），反应（640分钟），沉降（60分钟）和出水（5分钟）。 在反应时间内将培养基充气并连续搅拌。 两个反应器的污泥停留时间（SRT）和水力停留时间（HRT）分别保持在2天和1天。 对于SBR-A，pH值是通过加入1M HCl或1M NaOH控制在7.5plusmn;0.1。 在SBR-B的情况下，不使用pH值控制，其值范围在8.8至9.2。
两个反应器连续运行120天，并使用来自城市废水处理厂的活性污泥进行接种。 醋酸盐被用作唯一的碳以1.2 g COD Lminus;1和1.2 g COD Lminus;1dminus;1的有机负荷率作为进水流量通过SBR中底物的初始浓度除以反应器体积。 在每个循环中，体积交换率为50％。 KH2PO4（54.4），K2HPO4（43.6），NH4Cl（129.4）组成的培养基溶液（浓度以mg Lminus;1 ，MgSO4（43.9），MgCl2（160），CaCl2·2H2O（42），NaHCO3（30），minus;1）：FeCl3·6H2O（1500），H3BO3中含有微量元素溶液30mL以防止硝化的烯丙基硫脲（ATU50） （150），CuSO4·5H2O（30），KI（180），MnCl2·4H2O（120），Na2MoO4·4H2 Oslash;（60），ZnSO4·7H2O（120），CoCl2·6H2O（150）和68.5mL EDTA 0.5M(Tayagrave;等人，2015年）。 这产生了碳到氮到磷（C / N /P）重量比为100 / 10.3 / 6.1（以100g C为基准），其等于摩尔比为100 / 8.8 / 2.4（以100摩尔C为基准），即反应器在没有营养限制的情况下运行。
在SBR运行过程中进行了生物量、乙酸盐和溶解氧(DO)浓度的循环测量。 一旦达到稳定的操作性能，通过测量生物量，醋酸盐，PHA和DO浓度来表征SBR周期。 当悬浮固体（VSS）浓度和盛水期长度恒定至少5个周期时，考虑稳定操作。
2.2. PHA累积的批量实验取决于pH
为了评估富集培养物的PHA储存容量，在不同pH条件下进行批量积累实验：4.0,5.5,6.5,7.5,8.5和自由pH（范围在8.9和9.2之间）。 在每个循环结束时，从SBR收集0.5L生物质，并将其与0.5L与富集步骤中使用的相同的新鲜培养基混合。 连续几天进行实验以使与生物质组成的波动相关的影响最小化。
对于每个实验，使用1L玻璃反应器。 在整个实验过程中，生物质充气并磁力搅拌。 反应器在室温（约22℃）下操作，并使用0.6M HCl和0.6M NaOH在不同pH值下控制pH。 每个实验通过加入初始浓度为1.2g COD Lminus;1的乙酸进料脉冲开始。 定期采集生物量样本醋酸盐和PHA浓度，以及挥发性悬浮固体（VSS）。
2.3. 不同营养素浓度下的PHA积累能力的批次实验
进行类似的累积实验以评估在不同营养物浓度下富集培养物的PHA储存容量。 在这种情况下，从SBR-B收集到0.5L的生物质，并将其与0.5L的与之前相同的新鲜培养基混合，但是改变氮或磷的浓度使其在C / N / P摩尔比如下：a）100 / 4.1 / 2.4（N-限制实验），b）100 / 65.9 / 2.4（N-过量实验），c）100 / 8.8 / 1.3 100 / 8.8 / 90.5（P-过量）和e）100 / 4.1 / 1.3（N和P限制实验）。
如在前面的实验中那样，使用1L玻璃反应器并且在整个实验中生物质充气并磁力搅拌。 反应器在室温（约22°C）下运行，在这种情况下，pH保持自由。 通过添加乙酸盐（1.2g COD Lminus;1）的进料脉冲开始实验，然后生物质样品为用来分析乙酸和PHA浓度的演变。
2.4. 分析方法
按SBR-A和SBR-B的混合液样品测定总悬浮固体（TSS），按方法2540D，按照方法2540E进行VSS浓度。 污泥体积指数（SVI）基于方法2710D（APHA等人，2005)。
对于醋酸盐分析，取自反应器的样品用0.45mu;L孔径过滤器过滤并转移至2 mL隔垫瓶。 使用配备有DB FFAA柱（长度：30mu;m，内径：0.25mm和1mu;m厚度：0.25mu;m）和电离质谱离子化检测器（FID）的Agilent Technologies 7820A气相色谱仪测量上清液中的乙酸盐浓度。 使用氦气作为载气，在275℃下注入1mu;L的样品并进行分离，在2.9mLmin时比率为10:1minus;1。 烘箱温度最初设定在85°C并保持1分钟，然后增加3°C minminus;1，直到达到130°C。 第二个35°C min的升温minus;1保持在220°C。
对于PHA分析，将污泥样品与0.6mL甲醛混合以抑制生物活性。 随后，将样品冻干。 在分析过程中使用共聚物聚（3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸）和聚羟基-2-甲基戊酸酯（PH2MV）进行校准和标准化，因此其以与生物质样品相同的方式进行处理。 将冻干的样品称重并转移到带有螺帽的玻璃管中。 在所有管中加入苯甲酸作为内标。 向每个管中加入1.5mL丁醇和0.5mL盐酸，并在100℃温育8小时。 冷却后，加入2.5mL己烷和4mL MilliQ级水。 将管涡旋混合并将有机相转移至15mL干净的管中。 加入第二份4mL MilliQ级水等分试样，并将试管以2500xg离心10分钟。 提取有机相并转移至GC小瓶中，并通过在配备有FID检测器和HP-InnoWax柱（30mtimes;0.53mmtimes;1mu;m）的Agilent Technologies（7820A）气相色谱仪中注入1mu;L样品进行分析。 氦被用作载体气体在54毫升分钟minus;1。 喷油器的温度是220°C，检测器的温度是275℃。 烘箱温度设定为70℃2分钟，以10℃/分钟升至160℃并保持2分钟（Werker等人，2008)。
2.5. 计算
生物量中的PHA含量以质量基准计的VSS百分比计算（％PHA = gPHA / gVSS * 100），其中VSS包括活性生物量（X）和PHA。 通过从VSS中减去PHA含量（gX = gVSS-gPHA）计算活性生物量（X）。PHA生产（YPHA / AC在Cmol PHA / Cmol Ac中的产量）和通过将产生的PHA或生物活性生物质的量除以消耗的乙酸的总量，计算出所生产的活性生物质（在Cmol Xp/ Cmol Ac中的YXP / AC）。通过线性回归计算乙酸酯摄取率（在Cmol Ac / Cmol X中的-qs）和PHA生产率（在Cmol PHA / Cmol X中的qPHA）的浓度除以盛宴阶段结束时活性生物量的平均值。最后，饥荒比例（F / F比率）计算为盛宴阶段的长度除以饥荒阶段的长度。
3. 结果与讨论
3.1. 活
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