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光温条件对荒漠蓝藻开放式培养的影响
Shubin Lan a, Li Wub, Delu Zhang c, Chunxiang Hua,b
摘要
微藻培养近来被认为是用来解决日益突出的资源与环境问题的一个重要途径。在此研究中，荒漠蓝藻具鞘微鞘藻培养于库布齐沙漠的4个不同开放条件下，在培养期间发现小球藻、栅藻和舟形藻是主要的污染微藻种类。单独的高光强度是绿藻污染的主要原因，而高光强度与高温共同作用则有利于蓝藻的生长，获得的最大生物量为41.3mgL-1d-1。尽管所有微藻（包括目标和污染）仍需要一定的光照强度，至少日平均光照强度gt;5mu;Em-2s-1，但低温更适合于污染硅藻生长。总的来说，培养时间、培养条件和它们的相互作用都对微藻的光合活性（Fv/Fm）、生物量和胞外多糖含量（Plt;0.001）有着显著影响。
关键词：沙漠 微藻 开放培养 光合作用 胞外多糖
1.引言
随着资源与环境问题的日益加剧，微藻培养逐渐引起广泛关注。人们指出：微藻是可以将CO2转化为潜在的生物燃料、饲料、食品和高价值的生物活性物质的光依赖性碳固定生物体（Chisti, 2007；Bernnan and Owende, 2010）。因此，微藻培养不仅仅为人类提供更多的资源，也为CO2温室气体的消耗做出巨大贡献。同时由于微藻可以利用高营养废水（含有氮、磷等）来作为生长的培养基（Cantrell etal., 2008），因此微藻也可以利用和净化污水。另外，光合微生物对沙漠环境的改善也有一定作用，这是因为微藻生长和分泌胞外多糖可以达到固沙的效果，这样一来，松散的沙粒就可以被固定，而形成生物土壤结皮土壤也会结壳（Hu et al., 2012; lan et al., 2014）。生物土壤结皮在环境治理和生态修复方面起着重要作用，可以促进土壤系统甚至一系列更高级的植被群落的发展（Bowker, 2007; lan et al., 2014）。
对于微藻培养而言，场地的选择不仅直接关系到培养成本，而且还需要满足土地资源的合理使用要求。沙漠环境条件极端恶劣，比如土壤贫瘠、严重干旱、高盐度、高pH、高辐射、温度变化大以及风速快（Xie et al., 2007; Powell et al., 2015）等胁迫共存。在这种环境下，许多培养物的生长受到限制，一方面这使当地的经济发展困难重重，另一方面这也向沙漠化防护提出更大挑战。然而在这种环境条件下，许多种微藻都可以很好的存活，这是由于沙漠的特殊生理和生态特征，比如获得水后快速增长机制（lan et al.,2010;Wu et al.,2013）、在环境中迁移以更好地获得资源并避免过度辐射以及（Garcia-Pichel and Pringault, 2001)以及适应盐度、干旱、高pH值和温度的能力（Xie et al., 2007; Lan et al., 2010; Hu et al., 2012）。因此，选择沙漠地区作为微藻培养地点，不仅可以有效利用荒漠土地资源，而且还可以改善环境条件，促进当地经济发展。同时，分离和筛选沙漠地区的微藻资源将提供更高质量的微藻用于大规模培养，因为在目前的大规模微藻培养中，大部分为在实验室进行筛选藻类，并不能很好地适应现场多变的环境条件，导致一些特征变化（如产脂微藻类中脂质含量的降低（Zhou et al., 2013)），或被污染甚至死亡（Del Campo et al., 2007）。
为了获得微藻生物质，开放式生物反应器由于成本低、可用于大规模的微藻培养、结构简单、操作流程简单而得到广泛应用（Blanco et al., 2007; DaRosa et al., 2011）。但是，开放的生物反应器中的培养条件很难控制，从而在这些反应器培养出的微藻经常会有受到污染的风险（Gouveia, 2011）。在培养过程中，目标微藻可能被原生动物以及其他微藻种类污染。特别是当目标微藻类受其他微藻类污染时，污染的微藻类不仅与目标微藻竞争营养物质、光照和其他资源，而且还可能分泌一些化学物质毒害目标微藻，最终抑制目标微藻的生长（Wang et al., 2013; Mooij et al.,2015）。因此，在微藻培养中，了解不同种类微藻的生长特性将帮助我们更好地控制了培养条件，最终促进目标微藻的生长和控制污染性微藻的生长。
本实验中使用的具鞘微鞘藻是从达拉特旗的内蒙古的库布齐沙漠地区（内蒙古）生物土壤结皮中分离出来的。这种微藻的菌株是生物土壤结皮中的第一优势种，被选用以构建人造蓝藻结皮，从而促进生物土壤结皮的发育和当地生态系统的恢复（Lan et al., 2013, 2014）。所以在这项工作中，具鞘微鞘藻被开放培养于不同光照和温度条件下，以研究光和温度对胞外多糖的分泌，光合活性和微藻的生长的影响，并检查目标微藻在不同的培养条件下的污染状况。这个结果一方面可以帮助我们了解培养条件和荒漠蓝藻的代谢特征；另一方面也将为微藻污染控制和培养过程设计提供重要的理论依据。
2.方法
2.1研究地区和生物体
该实验在内蒙古达拉特旗地区进行。内蒙古位于库布齐沙漠的东部边缘（40°21′N，109°51′E），距离黄河中游约15公里，其特点是大量的沙丘平均高度为5m，海拔1040m。气候属于典型大陆性季风模式，多风天（gt; 5 m s-1）多超过180天。 年平均日照时间为2525h，平均年温度为5.8℃。 平均年降水量为284mm，主要在7月和8月之间下降。该年潜在蒸散量为2288mm，5月份的蒸散量最大。平均年相对湿度为50.9％，波动在35％至65％之间（图1）。
在这个实验之前，为了获得足够的微藻生物量，将具鞘微鞘藻置于装有无菌BG-11培养基1L塞子烧瓶中，将烧瓶置于恒温箱（25plusmn;2℃）中培养，冷却后白色荧光灯在40 mu;E m-2s-1下照明曝气（Xia et al.,2013; Ge et al., 2014）。
图1. 根据1978年至2005年的记录分析得到的库布齐沙漠地区的月平均气温、日照时间、降水量、蒸发量和相对湿度
2.2实验装置
在培养箱中获得足够的微藻生物质后，将具鞘微鞘藻接种到十二个18 L开放的垂直圆柱体生物反应器中，BG-11培养基和通气如上。该生物反应器是开放的，所以每天加入一定量的水到生物反应器抵消蒸发。生物反应器被放置在具有四个不同的盖罩阴影条件的透明温室中，具有自然光源。生物反应器在不同的阴影条件下分别定义为1、2、3和4。从实验组1到实验组4，光强度（生物反应器表面）逐渐下降，并且介质温度随光强度和环境空气温度而变化（图2；对晴天4种不同处理的光强度和温度在微藻培养过程中进行监测）。
具鞘微鞘藻在生物反应器中培养20天，分别在接种10天和20天后收获以测量微藻生物量（干重）和生物质生产力。另外，在培养过程中，每5天（16:00）采集微藻以测定叶绿素a（Chl），胞外多糖，光合活性（暗适应的Fv / Fm）和监测由其他微藻类造成的污染。取样时，每种处理中光照强度（生物反应器表面）和介质温度在同一时间进行测量。
2.3测量
2.3.1干重
在每个反应器中，收集0.5L微藻并离心浓缩，然后将微藻放入烘箱中（85℃）并干燥至恒重，记录重量作为微藻生物质（B；mgL-1）。生物量生产力（BP；
mgL -1d-1）根据下式计算：
BP =（B2-B1）=/T
这里B2和B1分别表示开始接种时和T时刻（天）的微藻生物量。
2.3.2叶绿素a（Chl-a）含量
在测量Chl-a含量之前，取25mL微藻并在900g下离心10分钟以除去上清液，然后用研钵将沉积的微藻与10mL 100％丙酮混合研磨，将提取物放置
在4℃过夜（12小时），然后再次离心（900g，10分钟）除去悬浮沉积物。在663nm，490nm和384nm处使用分光光度计测量上清液的吸光度A663，A490和A384，并且根据三基色方程Garcia-Pichel and Castenholz方程（1991）计算Chl-a含量。
2.3.3胞外多糖（EPS）含量
对于胞外多糖（EPS）测量，取2mL微藻并在900g下离心10分钟以除去悬浮沉淀物，并使用1mL每种上清液根据苯酚 - 硫酸法（Dubios等，1956）测量485 nm处的吸光度A485。胞外多糖含量（EC；mu;g mL-1）和A485值的关系可用下式计算：
EC = 120.06times;A485， R2 = 0.995 （以蔗糖为标准）
2.3.4 Chl荧光
在测量Chl荧光之前，取3mL微藻并暗适应处理10分钟。然后用植物效率分析仪（PEA，Hansatech，英国）测量黑色适应的微藻（液体）Chl荧光。 初始和最大荧光（Fo和Fm）由PEA自动记录，并通过Fv = Fm-Fo来计算可变荧光（Fv）。比率Fv / Fm是PSⅡ光化学的最大量子产率，反映了PSⅡ的最大光能转换效率，
并在此实验中获得了微藻的光合活性其特征在于暗适应的Fv / Fm（Baker，2008）。
2.3.5污染监测
对于污染监测，用显微镜直接观察培养的微藻并记录污染情况。 在微藻样品中，受污染微藻细胞比例gt; 10％作为严重污染；那些污染水平gt; 1％但是lt;10％被确定为中度污染，lt;1％作为轻微污染。
2.4数据分析
整个实验一式三份，对全部叶绿素a含量、光合活性（Fv / Fm）和胞外多糖EPS的变化使用单因素或双因素方差分析在95％，所有数据分析均使用SPSS 13.0软件进行。
3.结果与讨论
3.1光和温度对微藻污染的影响
图2. 晴天在微藻培养期间监测得到的4组实验中光强度（生物反应器表面；A）与介质温度（B）昼夜变化图
在4个实验组中，光强度（反应器表面）和采样时的介质温度如表1所示。从实验组1到实验组4，发现光强度和介质温度逐渐下降。从昼夜光强度的变化（图2A），发现实验组1和2最大的光照强度在中午（13:00），达到1200 mu;E m-2s-1 ，但低于1000mu;E m-2s-1。实验组3和4，特别是在4，最大的光线强度尚未达到30mu;E m-2s-1。
从昼夜介质温度的变化（图2B），发现在实验组1中最高的温度（15:00）超过35℃，并且
实验组2中不超过33℃，而在处理3和4中低于30℃。
表1. 不同处理的取样时间（16:00）的光强度（生物反应器表面）和介质温度
表2. 4个实验组在培养过程中微藻的污染情况（ 严重; 中等; 轻微）
总体而言，在达拉特旗地区培养微鞘藻期间，小球藻属、绿藻门栅藻属和硅藻门舟形藻属是主要的污染微藻物种（表2）。在本实验中，由小球藻引起的严重污染出现在实验组1和2接种5天后，这可能是由于那时候出现了高光强度（整个实验过程中取样时最大光强度为416mu;E m-2 s-1 ；表格1），这是因为据报道，绿藻似乎更喜欢高光强度（Lionard et al.，2005）。之后，小球藻污染逐渐减轻，这一方面可能是由于自第5天起光强降低（表1）；另一方面，蓝藻的大量生长可能抑制小球藻的生长。
在整个实验过程中，舟形藻在实验组2中引起中度污染，在实验组3引起严重污染，这可能是由于不同的温差所致，因为有人提出了低温更适合于硅藻的生长（Tilman et al.,1986；实验组3中的最高介质温度未达到30℃）。虽然介质温度在实验组4中（最高培养基温度同样低于30℃）也是低的，但只有轻微的舟形藻污染出现。这可能意味着硅藻的增长仍然是需要一定的光照强度，因为日均光照强度在实验组4中小于5mu;E m-2 s-1。
3.2光和温度对微藻生物量的影响
严重的小球藻污染出现在实验组1和2，中度和重度舟形藻污染分别出现在实验组2和3，最后实验组1和2的微藻干重没有受到显着影响，培养20天后超过440mgL-1（表3）。在实验组3中，虽然微藻干重在培养10天后达到300mgL-1，实验结束时此值降至仅123 mgL -1。在整个实验过程中，实验组4中的微藻干重维持在低水平，低于50 mgL -1。
叶绿素a是一种光合色素，存在于所有的光合生物中，且在光合生物体的比例相对稳定，因此经常用于指示光合作用生物量（Schumann et al.,2005）。从图3可以看出，在培养20天后叶绿素a的含量在实验组1和2中高于实验组3和4（P lt;0.05）。根据叶绿素a的变化曲线（图4），发现叶绿素a含量在实验组1和2中逐渐增加，尽管在实验组1后期观察到轻微减少。然而在实验组3中，尽管最初10天叶绿素a含量在一定程度上有所增加，但之后又迅速下降了。类似于干重的结果，在整个实验过程中，实验组4中的叶绿素a含量维持在与接种时相似的较低水平。双因素方差分析显示叶绿素a含量受到培养时间、处理方式及其相互作用的显著影响（P lt;0.001；表4
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