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加巴喷丁对斑马鱼早期发育及其抗氧化系统的生态毒理学效应研究

加巴喷丁(GAB)是一种新兴的污染物，在全球各地的水体中经常被检测到。 本研究以斑马鱼为模型生物，研究GAB对斑马鱼的早期发育及其抗氧化系统的影响。急性毒性实验表明，96h的LC₅₀的斑马鱼胚胎GAB值为59.9gL^-1。进一步观察到GAB引起胚胎畸形，如血凝和心包水肿。与对照组相比，当GAB(plt;0.05)浓度超过50mgL^-1时，心率显著增强，当GAB(plt;0.05)浓度为100mgL^-1时，游泳频率明显增加。 此外，斑马鱼胚胎的发育也受到GAB负面影响，表现为身体长度明显减少。GAB的浓度超过50mgL^-1时导致器官畸形和异常运动显著影响斑马鱼的发育。虽然在GAB浓度(0.1和10mu;gL^-1)下没有观察到明显的发育影响效应，但对其抗氧化系统的进一步研究发现，生物体内部因氧化剂发生了严重的损伤。以过氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽S^-转移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)和抑制羟基自由基(IHR)的抑制能力作为生物标志产生对不同浓度GAB的毒性。结果表明：在GAB环境暴露后CAT、LDH、GST和IHR的活性均升高，且ROS是由GAB暴露引起的。在所有这些生物标志物中CAT是评价GAB影响的最有效的生物标志，即使在非常低的浓度(0.1mu;gL^-1)下暴露也有显著的增加。

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收到2018年5月18日接受2018年6 月2日

DOI：10.1039/c8ra04250k

rsc.li/rsc-advances

导言

药物和个人护理产品(PPCPs)的广泛使用，令其在全球水生环境中分布广泛并且频繁被检测到。 例如，在1999-2000年期间研究人员抽样的美国河流，其中80%的样品检测到一种或多种化学品。加巴喷丁(GAB)是一种抗癫痫药物，用于治疗部分癫痫和神经病理性疼痛。¹ 2009年，德国消耗了58.9吨GAB，2012年增至73.3吨。^2,3 GAB在许多亚洲国家也得到了广泛的应用，如中国、印度、新加坡等。^4–6 GAB不易在生物群中被分解，因此人体排泄率很高。^7,8 当污水处理厂排放(STPs)时，其去除效率极低。

a 南 京 理 工 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院 ， 江 苏 ，211816， P. R.. 中国 。电 子 邮 件 ：heyd@njtech.edu.cn； y.zhang@njtech.edu.cn； 电话： 86-25-58139656

b湖南省可再生能源电气技术重点实验室，湖南长沙，410076，中国

³ 例如，R. Gurke等人在德国的STPs和出水中检测到56种PPCPs，并且发现GAB的去除效率仅为6.4%。⁹ 在明尼苏达州，研究人员对24种STP废水和很多种类的PPCP进行了采样，检测到其中GAB的浓度各不相同均在ngL^-1范围内。¹⁰ STPs去除效率很低导，致其在世界各地的地表水需要多次检测。在英国和美国，检测的GAB浓度水平均在ngL^-1。^11,12 在瑞士维迪湾，在饮用水里中检测到GAB浓度为400ngL^-1。¹³ 水生系统中的频繁检测到GAB，这引起了人们对其生态毒性的担忧，据我们有限的了解，在学术中很难找到相关于GAB生态毒性的研究内容。

在本研究中，斑马鱼(DanioRerio)被用作模型生物。 与传统的动物模型相比，斑马鱼有许多优点，如体积小，长成时间短，产卵量大，胚胎发育快速等。^14–16 另外，胚胎及幼体时期的斑马鱼都是透明的，^17,18 所以其相对容易观察到不良反应，如有毒物引起的异常变化。

近20年来，斑马鱼在毒性实验中得到了广泛的应用。^16–20胚胎毒性(FET)标准化OECD测试，用其做急性测试是最常用的替代手段。²¹ 在其整个生命周期，胚胎和幼体阶段是对化学物质反应最明显的阶段。^22–25 在孵化前，胚胎被绒毛膜包围约72小时中可能会在发育胚胎和化学品间提供一个保护屏障。^26,27 本研究将暴露时间延长到192hpf(培育时段)包含更重要发育阶段，从而获得更多关于生态毒性的信息。

暴露于污染物中的鱼类表现出明显的抗氧化防御能力，这些抗氧化防御能力被用作水生环境健康的生物指标。²⁸ 抗氧化酶，包括过氧化氢酶(CAT)和乳酸脱氢酶(LDH)是一条防御外氧化应激的主要标志，²⁹ 谷胱甘肽系统，包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)是次要标志。³⁰ 另外，几个非酶机制也可以表现抗氧化防御，如抑制羟基自由基(IHR)的能力。³¹ 肝脏是这些抗氧化酶产生的地方，目的是为了消除生物体中的活性氧(ROS)。³² 然而，在本研究中使用的96hpf的幼体太小，无法分离肝脏组织，因此使用整个幼体作为样本为酶活动测试做准备。

材料和方法

• 1. 化学品

GAB(CAS60142-96-3，纯度gt;98%)是从阿拉丁工业公司购买的。NaCl(CAS7647-14-5，纯度gt;99.5%)购自西隆科有限公司。CaCl₂-2H₂O(CAS10035-04-8，纯度gt;99.0%)购自中化试剂有限公司4MgSO₄-7H₂O(CAS10034-99-8，纯度gt;99.0%)，NaHCO₃(CAS144-55-8，纯度gt;99.5%)和KCl(CAS7447-40-7，纯度gt;99.5%)分别购自上海凌峰化学试剂有限公司。CAT套件( CAT.no：KGT017) ，GSH试剂盒( CAT. no：KGT006)，GST试剂盒(CAT. no：KGT005)，LDH试剂盒(CAT.no：KGT02448)，OH试剂盒(CAT.no：KGT010)和Bradford蛋白定量测定试剂盒(CAT.no：KGT801)是从KeyGEN生物技术有限公司购买的。

• 1. 斑马鱼培育和产卵收集

成年野生型斑马鱼(Tubingen线)是从南京YSY生物技术公司购买的，在我们的实验室培育至少一个月，然后在实验中使用。培育方法遵循其他地方详细描述的标准指导。³³ 成年斑马鱼被保护在一个在28plusmn;0.5℃的孵化器中且具有14/10小时的光和暗循环。 他们每天在5分钟内喂三次活的幼虾。在产卵前一天，一只雄性和一只雌性被转移到繁殖箱中，然后通过分割板被分离。

第二天，当光周期开始时，取出分割板，在一个小时内用胚胎培养基水收集胚胎并洗涤几次， 检测出其中含有2 mM CaCl₂-2H₂O， 0.5 mM MgSO4-7H₂O， 0.75 mM NaHCO3 和0.08 mM KCl(ISO 6341-1982)。34

• 1. 急性毒性实验

实验中GAB的NOEC值为10gL^-1。¹² 然而，没有计算LC₅₀斑马鱼胚的GAB浓度的急性毒性实验。 对于一般急性毒性实验，将胚胎从12phf开始持续96小时暴露在含有50、56、60、63、67、71gL^-1的GAB试液中。 这种暴露浓度是由一系列的预实验决定的。 在浓度为 4mg^-1有水的阴性对照和有水的阳性对照。3,4-二氯苯胺曾经在研究已使用。 选择12孔细胞培养皿（康宁公司，美国制造）作为实验室。 将10个活卵放入一个4mL培养液的槽中。 每个实验准备三个样本。用盖子覆盖培养皿防止暴露期间蒸发，还有保持孵化器温度在28plusmn;0.5℃，pH在7.11plusmn;0.05，电导率在293.6plusmn;2.4mu;scm^-1以及14/10小时的光和暗循环。在这种半静态暴露实验中，每天更换3mL培养液。 每24小时取出死胚并记录。

• 1. 生长期毒性实验

本实验是根据OECD TG236、OECD TG210和OECD TG212 组织准则设计和修改的。^35–37 将GAB浓度梯度设定为0.1mu;gL^-1，10mu;gL^-1，0.1mgL^-1，1mgL^-1，10mgL^-1，50mgL^-1 还有100mgL^-1并加上没有GAB的阳性对照和阴性对照。每组进行三次重复实验。培养条件与急性毒性条件相同。

在以下时间点观察胚胎或幼虫：6hpf，8hpf，12hpf，24hpf， 48hpf，72hpf，96hpf，120hpf，144hpf，168hpf，192hpf用生物倒置显微镜(日本尼康120c)或立体显微镜(江南JSZ6S，中国)拍照。 每天计算孵化率。 每个被测胚胎的根尖表现包括：胚胎凝固，没有躯体形成，尾巴不脱落，没有心跳。 畸形包括：色素沉着；卵黄畸形，心包水肿；卵黄囊水肿；血凝；尾部变形； 囊缺损。^38,39

为了观察GAB对斑马鱼发育的影响，使用几个端点来识别测试组和对照组之间的变化，如表1所示。^40,41

• 1. 抗氧化系统实验中的生物标志物

从12hpf到96hpf，实验组的胚胎暴露于0.1mu;gL^-1，10mu;gL^-1 和1mgL^-1 的GAB中，代表最坏的情况下现实的环境浓度与药学相关的浓度。

每组使用三个培养条件与上述急性毒性实验相同。暴露结束时，96hpf幼虫和胚胎在低温下死亡，4℃时使用手持式细胞破碎机

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