活性污泥中分离出的JDC-2和JDC-32协同降解PAE外文翻译资料

 2022-08-10 05:08

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活性污泥中分离出的JDC-2和JDC-32协同降解PAE

摘要:以邻苯二甲酸酯(PAE)的混合物作为唯一碳源和能量来源,从活性污泥中分离出了两个细菌菌株。通过16SrRNA基因序列分析,所分离的菌株分别被鉴定为戈登氏菌菌株JDC-2和节杆菌属菌株JDC-32。戈登氏菌菌株JDC-2可将邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)迅速降解为邻苯二甲酸(PA),并在培养基中积累。节杆菌菌株JDC-32可以降解PA,但无法降解DOP。戈登氏菌JDC-2菌株和节杆菌JDC-32菌株的共同培养突破了单种菌株的降解限制,达到完全降解DOP的效果。在降解中间体已确定的基础之上,提出了用戈登氏菌JDC-2菌株降解DOP的生化途径。研究结果表明,DOP是被活性污泥中所分离出的不同微生物的生化协同作用完全降解的。

关键词: 降解作用;邻苯二甲酸二辛酯;节杆菌属;戈登氏菌属;生化协同作用

1.简介

邻苯二甲酸酯(PAE)是一组化合物的统称,主要用作聚氯乙烯(PVC)塑料中的增塑剂。半个多世纪以来,它们一直被用来提高某些聚合材料的柔韧性。由于邻苯二甲酸酯与塑料生产原料的混合物之间并非化学键合,所以在产品的使用寿命期间它们很容易渗出[1]。因此,在全国各地的各种环境中都能够被检测到,例如沉积物、自然水体、土壤,甚至在大气中也有[2-5]。近年来,邻苯二甲酸盐由于疑似具有致癌,雌激素和破坏内分泌等特性[6],已成为极大的环境隐患。包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP),邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)在内的一些PAE已经被中国国家环境监测中心[7]和美国环境保护局列为优先污染物[8]

DOP是邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯(DEHP)的直链异构体,DEHP是最常用的增塑剂之一,其烷基链中有八个碳原子。在过去的几十年中,已经有大量关于PAE生物降解性的研究报道[9]。被普遍公认的是,与具有较长酯链的邻苯二甲酸酯(例如邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(DEHP))相比,具有较短酯链的邻苯二甲酸酯(例如邻苯二甲酸二甲酯(DMP),邻苯二甲酸二乙酯(DEP)和邻苯二甲酸二丁酯(DBP))更易于生物降解和矿化 [10-13]。尽管对DEHP在各种条件下的降解情况已经进行了许多研究[14-19],但是关于DOP生物降解性的研究却很少[7,20-22]。而且研究发现DOP的降解速率相对较慢。因此,分离出可以完全降解DOP的细菌菌株具有重要意义。尽管某些微生物能够完全矿化邻苯二甲酸酯,但环境中混合的微生物种群似乎可以更有效地提高降解效率 [1]。迄今为止,相比于单一菌株的分部利用,已有许多关于混合培养物联合体完全矿化特定PAEs的报道[23-26]。但是以前关于DOP降解的研究大多数都把注意力集中在纯化物的初步降解上[20-22]。因此,尚未有关于由筛选后的微生物混合体完全降解DOP的研究发表。此外,生化途径降解DOP的表征目前无文献描述。

目前的研究描述了活性污泥中分离出这两种降解PAEs的细菌菌株及其特性。并且发现这两种菌株结合起来可完全降解DOP。此外,在确定了可能的降解中间体的基础上,本文提出了DOP的降解途径及每种微生物在降解中作的贡献。

2 材料和方法

2.1 化学制品

纯度为99%的DOP和邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)购自Aldrich-Sigma Chemicals(密苏里州圣路易斯)。邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DIOP)均从中国医药集团获得。所有其他化学试剂均为分析等级,所有溶剂均为HPLC等级。

2.2 微生物来源

从两个样品(A和B)中分离出用于降解实验的细菌。样品A来自湖南省常德市定城区收集的河道污泥,而样品B是从江西省永新市曲江采集的污水污泥。实验前将污泥样品保存在塑料袋中,并在4℃下保存一周。

2.3 细菌富集和分离

在所有实验(包括富集实验)中使用的最小盐培养基(MSM)[27]包含(g / l):K2HPO4 5.8 g,KH2PO4 4.5 g,(NH4)2SO4 2.0 g,MgCl2 0.16 g,CaCl2 0.02 g,Na2MoO4·2H2O 0.0024g,FeCl3 0.0018g,MnCl 2·2H2O 0.0015g。用HCl或NaOH将MSM的pH值调节到7.0,然后121℃高压灭菌20分钟。将18 g琼脂添加到1L MSM中以制备琼脂平板。富集过程类似于Chao等人所描述的[27]并在此基础上进行了一些修改。最初,将5.0 g污泥添加到含有200 ml MSM溶液的500 ml锥形烧瓶中,用PAEs(200 mg/l)的混合物(每50 mg/l)对DMP、DEP、DBP和DOP进行修正。在30℃下黑暗环境中,将悬浮液置于转速为175转/分的旋转振动筛上培养7天。随后,将2ml的富集培养物连续转移四次至新鲜培养基(每个均含有较高浓度的PAEs(240-500mg/l))中,并在相同条件下培养。然后用接种环将最后的浓缩液在MSM琼脂(18g/l)平板上划线,再添加PAEs混合物(500mg/l),并在30℃下培养1周。根据菌落形态和颜色的差异筛选出所需的菌落,并将其重新划线到用PAE混合物改良后的MSM琼脂平板上。细菌分离物可通过在LB营养琼脂平板上划线培养来进一步纯化,然后分别在含有和无PAE的条件下再分别划线到MSM琼脂平板上以确认其降解能力。筛选出在含有PAEs的培养基中显示生长,但在无PAEs下不显示生长的分离株进行下一步研究。

2.4细菌的鉴定和生物学特性

在光学显微镜下观察染色细胞的革兰氏反应和细胞形态。首先通过生理生化标准鉴定方法对细胞进行鉴定,再使用16S rRNA基因测序法对纯培养的菌株进行了进一步鉴定。为了提取用于16S rRNA基因扩增的菌株基因组DNA,吸取2ml经PAEs修饰的MSM液体培养液并离心。用磷酸盐缓冲液(PBS,0.05mol/l,pH7.4)洗涤细胞颗粒三次,然后在200 l Tris/EDTA(TE)缓冲液(pH8.0)中重新悬浮。根据制造商的说明,使用EZ-10旋转柱基因组DNA微量提取试剂盒(Bio Basic Inc.,加拿大万锦,加拿大安大略省)提取基因组DNA。然后用细菌通用引物F27和R1492扩增来自基因组DNA的16S rRNA基因。按照制造商的说明,使用E.Z.N.A.凝胶提取试剂盒(Omega Bio-Tek,Inc.,Doraville,GA)纯化PCR产物,然后对其进行测序(中国上海Sangon)。将细菌的16S rRNA基因序列进行比对并与DNA序列数据库中的细菌基因序列进行比较。在美国国家生物技术信息中心(NCBI)建立的DNA序列数据库检索最接近的并引用,并将其与CLUSTALW对齐,所有参数均设置为其默认值。然后通过邻居连接算法和MEGA4.1中实现的碱基取代的Kimura II参数模型生成系统发育树。使用引导程序分析重复1000次,对发育树进行验证。

2.5 基质利用率测试

对菌株JDC-2和JDC-32在各种碳源上的生长能力进行测试。分别以原儿茶酸(PCA)、邻苯二甲酸(PA)、DMP、DEP、DBP、DOP、DIOP和DINP(200 mg/l)作为碳源,对液态MSM进行补充,以检测PAEs降解菌株利用这些化合物的能力。将PA和PCA溶解在氯仿中,并通过0.22 m的膜过滤进行灭菌。将另一些直接加入MSM培养基中并高压灭菌。使用UV-9200分光光度计(Rayleigh Analytical Instrument Corp.,北京,中国)通过在600 nm(OD600)处的光密度测量和显微镜观察来确定培养瓶中的微生物生长情况。

2.6 降解实验

30℃下将添加有PAE的MSM置于旋转振荡器上,以150 rpm的速度运转36 h后收获细胞,在无菌条件下用0.05 mol / l磷酸钾缓冲液(pH 7.5)洗涤3次,使其重新悬浮在相同的磷酸盐缓冲液中至OD600为0.2。分别研究各菌株(1毫升悬浮液)和混合体(1毫升各菌株)在20毫升无菌MSM中降解DOP(500毫克/升)的情况,将这些MSM放在50毫升锥形烧瓶中,在30℃下在转速为150转/分的旋转振动筛上进行培养。使摇床在黑暗中以150 rpm的速度运转。每隔6小时将20 ml二氯甲烷直接添加到各个烧瓶中,然后剧烈振摇3分钟。将得到的重质乳液离心(5000 rpm,5分钟),并将水相萃取两次。将二氯甲烷相蒸发至干燥,溶解于10ml甲醇中以作进一步分析。同时研究在相同条件下,在200毫升灭菌后的MSM中的每株菌种(1毫升悬浮液),在500毫升的锥形烧瓶中对PA(500毫克/升)的降解情况。定期用无菌注射器取出含水样品(1 ml),并保存在-20℃下以进行光密度测量和进一步的HPLC分析。所有实验均重复三次。以类似的方式定期分析样品和进行无菌对照(未接种的MSM)。如前所述,通过测量光密度(OD600)来确定培养瓶中的微生物生物量。

2.7 HPLC分析残留底物

将冷冻的等分试样解冻,通过0.22m的膜滤器过滤,然后注入(20L)配备有UV230 紫外检测器和Hypersil BDS-C18(200m mtimes;4.6mm,5m)色谱柱的高效液相色谱系统(Elite系列;Elite,中国大连)。用于检测DOP的流动相为甲醇:水(90:10,v / v),流速为1 ml/min,紫外线波长为254 nm。用于分离PA的流动相为甲醇:1%乙酸水(40:60,v / v),流速为0.5 ml/min,紫外线波长为228 nm。校准曲线在12.5–500 mg / l范围内呈线性。

2.8 通过GC / MS分析DOP降解的衍生产物

为了检测降解过程中的次要中间产物,将上面提取的样品浓缩至1 ml,然后使用配有极化离子阱质谱仪(GC-MS,Thermo Electron Corporation,Austin,TX)的Thermofinigan痕量GC2000进行GC/MS分析。采用超纯氦为载体(流速1 ml min-1),在30m DB-5MS弹性石英毛细管柱(0.25 m膜厚,内径0.25 mm;温度保持在60°C 3分钟,从5°C 每分钟到280°C 每15分钟,然后迅速冷却到60°C)上进行气相色谱分析。对于以正电子电离(EI)模式收集的质谱图,源温度为250℃,电子电离能为70 eV,质量范围为40–500 mu,并以分离模式(1:10)注入1 l提取样品。通过与标准化合物的保留时间和质谱图进行比较,使用NIST质谱检索程序(美国国家标准技术研究院,盖瑟斯堡,马里兰)来鉴定信号。

3 结果

3.1 分离和生物学特性

在琼脂平板和液体培养基上获得了两种细菌分离株(JDC-2和JDC-32),它们可以利用琼脂平板和液体培养物中的PAE混合物作为唯一碳源和能量来源。 JDC-2菌株是戈登氏阳性棒状需氧菌,会在LB琼脂平板上形成圆形红色菌落。菌株JDC-32也是戈登氏阳性专性需氧菌,在LB琼脂平板上形成黄色光滑的圆形菌落,呈杆状球菌循环。表1总结了这两个分离株的某些表型特征。基于BLAST对其16S rRNA基因序列的分析,JDC-2属于Gordonia属(GenBank登录号FJ851356),而JDC-32似乎是节杆菌属(FJ851358)。图1说明了JDC-2和JDC-32与它们的近亲

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