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从污水污泥中分离的新型磷酸盐溶解细菌和磷酸盐溶解机理
摘要：农业土壤中的大量不溶性磷酸盐不能用于农作物。从活性污泥和土壤中分离出的三株细菌（巨芽孢杆菌YLYP1，假单胞菌prosekii YLYP6和假单胞菌sp.YLYP29）可以有效地溶解磷酸三钙。特别是新菌株P. prosekii（高效磷酸盐普罗塞克菌） YLYP6在最佳培养条件下[20°C，pH 7.9，接种量为0.5％（体积比）]在6天内产生716 mg/L的有效磷酸盐，采用响应面法确定。P. prosekii YLYP6在pH（5-9）和温度（15-35°C）的广泛变化中表现出高效的磷酸盐溶解作用。该菌株的磷酸盐溶解曲线符合一级动力学模型（R2gt;0.939），钙磷酸盐的半衰期为1.51-5.94天对于5.0g/L。由连续培养实验结合扫描电子显微镜观察和气相色谱-质谱分析表明，由P. prosekii YLYP6以丙二酸为原料，产生的2,3二甲基富马酸、葡萄糖酸和正丁基-叔丁胺通过提供H 离子和有机阴离子来实现磷酸盐的溶解。P. prosekii YLYP6在实际土壤中有效的磷酸盐溶解显示出强烈的应用潜力，以减少化学磷肥的使用和由此产生的农业非点源污染。
关键词：生物肥料；代谢产物；有机酸；磷酸盐溶解细菌（PSB）；磷酸盐溶解机制；假单胞菌prosekii。
1.简介
磷（P）缺乏是世界范围内的普遍现象在农业土壤中，因为在任何给定时间只有一小部分（lt;1％）总无机磷和有机磷溶解，导致对磷化肥施用的强烈需求。然而，过量施用磷化肥以及其低利用效率会造成广泛的环境污染，特别是在中国，这是最大的化学肥料消费者之一。 2015年，中国农业部发布了《2020年化肥消费零增长行动计划》的公告。有机肥料，特别是那些含有磷酸盐溶解细菌（PSB）的生物肥料，由于它们结合了回收有机废物、引入有益微生物和提供有机物质的优点，因此在减少化肥的使用方面非常有希望。许多陆地区域的总磷量很高，但在土壤中的利用率通常很低。因此，研究提高农业土壤中固定化磷的生物利用度、减少磷化肥的施用以及相应的环境影响具有重要意义。PSB在农业生态系统中可溶性和不溶性磷的生物地球化学循环中发挥关键作用，因为它们将不溶性磷转化为植物可获取的可溶性磷。从固体废弃物堆肥、根际土壤和金属污染土壤等不同的环境隔室中分离到了PSB，但鲜有报道将其从活性污泥中分离出来，这是一个丰富而潜在的微生物资源库。实际上，已经从活性污泥中分离出各种能过滤氮和降解有机污染物的功能性细菌，如一氟乙酸、二氟乙酸和三氟乙酸以及邻苯二甲酸酯。利用功能菌污泥作为生物肥料是一种极具潜力的改善土壤性质的方法。Stefaniuk等人在2017报告称，在长期现场实验中，污水污泥和生物炭的共同应用增强了施肥土壤中多环芳烃的消散，许多细菌如泛酸杆菌、巨芽孢杆菌、红球菌、热带伯克霍尔德菌和假单胞菌，表现出强大的磷酸盐溶解特性，因为它们可以在常规条件下处理214–581mg/L磷酸三钙[Ca3（PO4）2]进行培养。然而，这可能不足以支持实际要求，因为PSB的磷酸盐溶解能力受到非生物胁迫因素的严重影响，例如土壤的温度，有机物含量，质地，水分和土壤pH。PSB应该能够与土著土壤微生物竞争，并成功地定殖该土壤。因此，需要对各种环境条件具有广泛适应性的更有效的PSB。
PSB将不溶性磷形式转化为生物可利用的可溶性磷形式的磷酸盐增溶机制是复杂的，涉及酸化、氧化还原反应、排泄有机酸（OAS）和有机配体（OLS）、微生物产生胞外聚合物物质以及几种磷酸酶的合成。PSB产生的有机酸或其他代谢物以及由此导致的介质pH值降低通常被认为是磷-可再生原料增溶的主要机制。人们普遍认为，PSB产生的有机酸（例如葡萄糖酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、乳酸、甲酸和乙酸）对培养基进行酸化，通过质子化将Ca3（PO4）2转化为生物可利用的磷酸盐。然而，仅对黑曲霉和肠杆菌对PSB产生的有机酸进行了定量分析，而其他PSB的相关活动，如具有高效磷酸盐溶解能力的假单胞菌（Pseudomonas sp.），仍不清楚。此外，之前的研究还没有确定哪些有机酸或其他代谢物是磷增溶的原因。因此，需要更多的证据来解释不溶性磷酸盐是如何被有机酸或PSB产生的其他代谢产物溶解的。PSB在矿物磷酸盐的增溶过程中，磷释放到溶液中通常遵循振荡动力学，但振荡机制仍不清楚。
本研究的目的是:（1）分离和鉴定能有效溶解磷酸钙的新型菌株；（2）响应面法优化影响磷酸盐增溶的条件；（3）研究PSB在液体介质中溶解磷酸钙的动力学；（4）通过扫描电镜(SEM)和气相色谱-质谱(GC-MS)检测代谢物，阐明磷酸盐的增溶机理；（5）研究PSB在实际土壤中的磷酸盐溶解能力。希望本研究能大大提高我们对PSB增溶磷酸盐机理的认识，并为PSB的应用提供有前景的前景。
2.材料和方法
2.1样品和介质
所有溶磷菌株的样品均来自中国广东省的两个地点。从广州市某污水处理厂(北纬113°13′34.78”，东经23°07′44.36”)的曝气池出口、沉淀池出口和脱水剩余污泥中分别采集3份活性污泥样品。在沿海城市汕尾的一个农场(北纬115°13′48.43”，东经22°58′31.08”)采集了4个土壤样本。样品保存于4℃，50mL无菌离心管中。
本研究采用的培养基为: 卢里亚·贝尔塔尼姆 (LB)，其中含有色氨酸(10 g/L)、酵母提取物(5 g/L)和NaCl (10 g/L)；皮科夫斯卡亚培养基(PVK)含有蔗糖(10 g/L)、(NH4)2SO4(0.5 g/L)、NaCl(0.1 g/L)、MgSO4·7H2O(0.1 g/L)、KCl(0.2 g/L)、MnSO4(0.03 g/L)、FeSO4·7H2O(0.03 g/L)和酵母提取物(0.5 g/L)；国家植物研究所磷酸(NBRIP)生长培养基中含有(g Lminus;1)葡萄糖(10 g/L)、MgCl2·6H2O(5 g/L)、MgSO4·7H2O(0.25 g/L)、KCl(0.2 g/L)和(NH4)2SO4 (0.1 g/L)。 PVK和NBRIP培养基中含有0.5% (w:v)处理过的Ca3(PO4)2为P的唯一来源，固体培养基中含有1.5% (w:v)琼脂。Ca3(PO4)2在超声波浴中用双蒸馏水清洗，50℃烘干。所有材料使用前均在121℃高压下灭菌20分钟。
2.2可溶性磷酸盐菌株的分离
根据平板上清晰光晕的出现和液体培养中磷酸盐的高效溶解，将分离物定义为PSB。将活性污泥样品以5000 r/min离心10分钟去除水分。所有样品均在无菌双蒸馏水(样品:水= 1:10 00,w:v)中加入0.9%(w:v) NaCl均质，然后在30°C的生化培养箱中摇晃9小时。经过连续稀释(10-1-10-4) 用灭菌的双蒸馏水，将100mu;l的等份溶液镀在含有处理过的Ca3（Po4）2的PVK琼脂板（pH7）上，用于PSB的初始选择性筛选。在30℃孵育7天后，根据透明晕的外观从平板中选择细菌菌落，并对分离的菌落进行纯化2周，包括在PVK琼脂固体培养基上纯化1次和在榜固体培养基上纯化3次，纯化后，每个分离物作为甘油储备储存在-20°C。
2.3接种物制备
在LB培养基中生长的纯化菌株，以5000 rpm离心5 min, 0.9%(w:v)无菌盐水溶液洗涤三次，获得接种物。冲洗后的细菌在盐水中复苏，重新悬浮。细菌浓度(cfu/ml)用稀释平板计数技术测定悬浮液中的含量。除另有说明外，所有实验均使用UV-2450分光光度计(日本东京岛津市)在600nm处测量光密度，以0.5的OD600nm作为接种浓度。
2.4磷酸盐溶解
进一步研究了磷酸盐在液体培养中的增溶能力。首先，将接种物大小为4%（OD600nm=0.5，v:v）的菌株接种到含有100 ml PVK培养基的250 ml锥形培养基中，并在150 rpm和30°C的旋转摇床上培养7天，以测量磷酸钙的溶解活性。然后，在与pvk培养基相同的条件下，将具有较高溶磷能力的菌株接种到NBRIP培养基上。在6000 rpm下离心培养液10分钟，用磷钼酸盐法测定磷浓度。单独的肉汤培养基接种无菌的超纯水作为对照。此外，还从广东省微生物培养中心（广东）采购了一株巨大芽孢杆菌菌株作为PSB，作为参考。
2.5分离菌株的鉴定和特征
经过连续筛选，筛选出高效的磷增溶菌株进行进一步研究。通过扫描电镜观察菌株的形态，参照Bergey的细菌测定手册进行了生理生化试验。根据美国国家环境保护局的规定提取了粗DNAreg;细菌DNA试剂盒协议。利用Calheiros等人描述的通用引物27F（5′-GAGGTTATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACCTTTTTACGACTT-3′）获得细菌菌株16S rRNA基因的部分序列。反应混合物由10 mM的dntp、2.5 U的Taq DNA聚合酶、5.0mu;L的10times;pcr缓冲液、5.0 mMm MgCl2、3.0mu;L的DNA模板和1.0mu;L的每种引物组成。将去离子水添加到反应混合物中，最终体积为50mu;l。PCR程序包括在Zhao等人（2016A）的变性步骤。所得到的细菌序列与NCBI GenBank数据库中的
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