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在水稻生命周期中土壤 - 水稻体系内CuO纳米粒子的归趋和转化
Cheng Peng, Chen Xu,Qinglin Liu,Lijuan Sun,Yongming Luo and Jiyan Shi
浙江大学环境与资源学院环境工程系，杭州310058
东华大学环境科学与工程学院环境科学系，上海201620
浙江百思达环保科技有限公司，浙江杭州310015
中国科学院烟台海岸带研究所沿海带环境过程重点实验室，山东烟台264003
浙江大学水污染控制与环境安全国家重点实验室，杭州310058
摘要：
农业土壤逐渐成为金属纳米粒子（MNPs）的主要沉淀物。作物对MNPs的吸收和积累可能污染食物链并对人类健康构成意外风险。在这里，我们研究了在水稻生命周期中，土壤 - 水稻系统里的CuO纳米颗粒（NPs）的归趋和转化。结果表明，在成熟阶段，相比于对照组，1000 mg / kg CuO NPs显着降低了氧化还原电位202.75 mV，但电导率提高了497.07 mS / cm。此外，土壤中最高CuO NPs的生物有效性随着植物生长而降低了69.84％，但在干湿循环后显着增加了165％。同时，通过X射线吸收近边结构分析，将CuO和Cu与腐殖酸结合，转化为Cu2S和与针铁矿相关的Cu。此外，CuO NPs对植物生长的负面影响大于散装颗粒，这大大降低了谷物的鲜重至对照组的6.51％。值得注意的是，发现CuO NPs从土壤转移到植物，尤其是转移到水稻中，并且通过微X射线荧光技术促进了水稻糊粉层中的Cu积累，但是不能到达精米。
■简介
纳米技术的快速发展最终导致全球各种工程纳米粒子（NPs）的大规模生产。作为典型的金属基纳米粒子（MNPs），CuO纳米粒子具有各种重要的应用，如能量转移1，染料降解2，农业中的敏感气体传感器3，日常必需品中的抗菌媒介物4。不完全统计显示，早在2010年，Cu NPs和CuO NPs的全球产量已经达到200吨/年，目前仍在大幅增加.5然而，大多数MNP可以通过废水处理厂污水污泥的再利用而引入农业土壤。纳米化肥，除草剂和农药的使用。6,7此外，NPs可以从纳米传感器的应用，原位环境修复和纳米技术产品的废物中释放。8此外，大气沉积和运输中的意外排放也可能有助于此。因此，这些MNPs在农业土壤中的潜在污染可能对环境和生态系统构成威胁。
一旦被释放到土壤中，MNP可以接触到土壤颗粒，天然有机物质（NOM）和生物体。 MNPs带来的实际环境风险主要取决于土壤中MNPs的种类和生物有效性。许多研究表明，pH，离子强度和NOM等几个环境因素都会影响水生环境中的MNP行为。10尽管如此，由于土壤系统动态特征分析的不确定性和复杂性，人们对土壤中MNPs归趋和转化的认识仍然有限。与旱地相比，诸如水稻田等湿地具有涝渍现象发生，而且水稻田中水的特定管理，也可能会影响MNP的流动性，溶解性，生物利用度和毒性。此外，MNP，微生物和植物之间的相互作用可能会改变MNP的形态。因此，研究水稻土中MNPs的归趋至关重要，这有利于控制MNPs向农产品甚至地下水体转移的风险。
植物作为生态系统的重要组成部分，也在MNPs的分解中发挥着重要作用。我们以前的研究表明，耐铜植物Elsholtzia splendens（海洲香薷）和水稻可以在水培条件下实现CuO NPs从根到芽的直接吸收，积累和转移，11,12这个过程涉及吸附，聚集，溶解和氧化还原。10事实上， MNPs的环境行为在很大程度上取决于MNP特性，植物种类和培养基。早期的研究表明，土壤 - 植物系统中没有Fe3O4 NPs和Al NPs的转移13,14，但最近的研究表明土壤中的TiO2 NPs在小麦根中被吸收和积累，15之后转移到黄瓜的叶状毛状体中，9同样，从土壤，米根17，大豆根，根瘤18，大豆豆荚中发现了CeO2 NPs的易位。19 Dimkpa等已经研究了CuO NPs从沙子到小麦幼苗的转运和归趋，但是仍然缺乏植物对CuO NPs的响应以及植物中CuO NPs在较长时间尺度（即整个生命周期）上的转化。
作为世界上大多数人口的热门主食，水稻（Oryza sativa L.）相比于其他任何的一种单一的食物，可以提供更多的卡路里。21由于在变化的土壤湿度条件下MNP的溶解度和生物利用度可能增加，与小麦和豆类等旱地作物相比，水稻作为水生植物更有可能从MNP中获益。 此外，根系分泌物和根部氧分泌的特征可能会加强对MNPs的影响。因此，MNPs是否可以在水稻的可食部分易位和积累，对于评估MNPs对人类健康的风险非常重要。16
本研究的主要目的是（1）研究MNPs对土壤性质的动态影响; （2）利用其特定的水管理方法，探讨水稻田土壤中MNPs的生物有效性和形态; （3）探讨MNPs在整个生命周期中对植物生长的影响以及植物中MNPs的归趋和转化。 这项工作将有助于评估MNP的环境和生态风险及其对农产品安全的影响。
■材料和方法
CuO颗粒：
在我们之前的研究中解释了CuO NPs和块状颗粒（BPs）.11,12 CuO NPs的初级尺寸为43plusmn;9 nm，球形，去离子水中的流体动力学直径为240plusmn;23 nm，具有特定的表面积 131平方米/克，纯度超过99.9％。 据报道，CuO BP的粒径超过1000nm。
植物栽培与治疗：
水稻（Oryza sativa L.）种子来自中国的Wuwangnong组。 溶液培养的具体方法如前所述。12简而言之，种子用次氯酸钠消毒，在25℃的黑暗条件下在潮湿的纱布上发芽一周，然后转移到营养液中（支持信息（SI）表） S1和S2）持续2周。22水稻幼苗在植物电子管中生长，相对湿度为60-70％，白天温度维持在25℃（16小时），夜间维持在20℃（8小时）。
表层土壤来自中国杭州市京山镇某处（119°51#39;E，30°22#39;N）。在SI中描述了土壤特征测定以及土壤和CuO颗粒混合的方法。土壤的pH为5.30，有机质为4.15％，阳离子交换容量为6.71cmol / kg。砂、淤泥和粘土含量分别为11.1％、57.0％和31.9％。土壤中总Cu的浓度为11.43mg / kg（SI表S3）。空气干燥后，将收集的土壤过筛至小于2mm。将CuO颗粒作为粉末加入到空气干燥的土壤中进行每次处理，并在种植前稳定24小时。18CuO NPs的目标浓度为50，100，500和1000 mg / kg（干质量/空气干燥土壤质量基准），而CuO BPs的目标浓度为1000 mg / kg。根据先前的研究20,23,24和水稻土中NPs的低流动性，选择这些水平的CuO颗粒。将未加标和空气污染的土壤被设定为对照。将CuO和风干土壤的每种混合物置于聚氯乙烯（PVC）容器（16cm直径times;30cm高）中，然后移植均匀的水稻幼苗（S1图S1）。在土壤培养开始时加入肥料（60mg N / kg，来自CO（NH 2）2,100mg P 2 O 5 / kg和100mg K 2 O / kg）作为溶液用于植物生长，并在分蘖期和抽穗期供应额外的尿素（45mg / kg）。植物培养在具有自然光和温度范围为20至32℃的温室中进行。在该实验中我们使用了72个盆（六个处理组times;一式三份times;四个生长阶段），每隔48小时用去离子水灌溉以获得水饱和的土壤并将水层的深度保持在土壤表面上4cm。并且在抽穗阶段之后采用干 - 湿交替的操作模式，盆中的土壤水分经历4次干 - 湿循环，每个干 - 湿循环持续7天。通过自然蒸发进行干燥，而通过向土壤表面添加去离子水手动进行润湿。在干 -润湿循环期间，盆中的土壤水分在40％和15％之间变化。
根据植物生长状况，在第7天，第21天，第60天和第88天收集植物和土壤样品，分别处于苗期，分蘖期，抽穗期和成熟期。 同时，使用配备有pH电极（ROSS）的离子分析仪（Thermo-Orion，Beverly，MA）原位测量土壤pH，氧化还原电位（Eh）和电导率（EC）的值，氧化还原电位 电极和电导率计。
土壤中铜元素的单一化学萃取：
在-70℃实验室冷冻机中预冷冻过夜后，将土壤样品在-56℃和0.280mbar压力下在冷冻干燥器（Alpha1-4LSC，Marin Christ Ltd.，Germany）中冻干48小时。 SI表S4显示了用于确定CuO NP在土壤中的生物利用度的单一化学提取方法的细节。 摇动后，将土壤和试剂的混合物在12000g下离心10分钟，然后通过定量滤纸（1-3mu;m孔径，Whatman Xinhua Limited Company，China）过滤。 通过原子吸收光谱仪（AAS，MKII M6，Thermo Electron，Waltham，MA）测定收集的液体中的Cu浓度。
图1.在水稻生命周期中暴露于CuO NPs和BPs的土壤的PH（A），Eh（B）和EC（C）。pH，Eh和EC的值以一式三份样品的平均值plusmn;SD给出。不同的字母表示治疗方法之间的显着差异（p lt;0.05）。
植物生物量和铜含量的测定：
在每个生长阶段，用去离子水洗涤收集的新鲜植物以除去根部的土壤。 然后分离芽和根，测量它们的高度，鲜重，干重和含水量。 记录了新鲜的重量和填充的谷物和未加工的谷物的数量。先前描述了植物中的Cu含量测定。在这之后，使用微波归趋装置（MARS5，CEM Microwave Technology Ltd.）将植物干燥，研磨并用HNO 3 -H 2 O 2（1：4，V / V）(MARS5, CEM Microwave Technology Ltd., Matthews, NC)。 通过电感耦合等离子体 - 光学发射光谱仪（ICP-OES，iCAP 6300 DUO，Thermo Fisher Scienti fi c Inc.，Waltham，MA）分析消化植物中的Cu含量。有关ICP的质量保证/质量控制（QA / QC）的信息在SI中有所描述。
近边缘结构的散射X射线吸收（XANES）：
分析Bulk-XANES用于表征土壤和植物中的Cu化学形态。 将土壤和植物样品在-70℃下预冷冻过夜，并在-56℃和0.280mbar下冻干72小时，然后研磨成粉末，压成薄片，用胶带覆盖，并置于样品架上。 样品和参考的Cu K边缘XANES光谱主要记录在北京同步辐射装置（BSRF，北京，中国）的光束线1W1B上。 其余的XANES光谱是在上海同步辐射装置（SSRF，中国上海）的光束线14W1上收集的。 根据Strawn方法制备吸附在腐殖酸上的Cu和吸附在针铁矿上的Cu的参考样品。25 SI提供了大量XANES分析的详细信息。 IFEFFIT Athena软件用于处理XANES数据。11
图2.在水稻生长期间通过CaCl2 （A），EDAT（B）和DTPA（C）提取的土壤中的Cu含量。Cu含量的值以一式三份样品的平均值plusmn;SD给出。不同的字母表示治疗方法之间的显着差异（p lt;0.05）。
微X射线荧光（mu;-XRF）分析：
进行mu;-XRF分析以表征颗粒中的元素分布。将大米样品在-70℃下预冷冻过夜，然后冻干（-56℃，0.280mbar）48小时。将精米沿其纬度轴分成两半，将没有细菌的半粒薄片粘在胶带上（Scotch 810,3M Company，St.Paul，MN）并固定在样品架上进行实验。26mu; -XRF实验在BSRF的光束线4W1B上进行，其运行2.5 GeV电子，电流范围为150至250mA。激发能量通过W / B4C双多层单色仪在15keV下单色化。然后通过Kirkpatrick-Baez镜和多毛细管透镜将入射光束聚焦到50times;50mu;m的大小。获得2D映射的方法如下：将样品架固定在精密马达驱动台上，然后以500mu;m的步长扫描所选位置。应用Si（Li）固态检测器检测XRF发射线，其活动时间为60秒。使用PyMCA包进行mu;-XRF数据的减少和处理。27
图3.模型化合物的XANES Cu K-边缘光谱，用500 mg / kg CuO NPs（A）处理的土壤样品，以及在成熟阶段暴露于500 mg / kg CuO NPs和1000 mg / kg CuO BPs的水稻植物（B）; 红色虚线是线性拟合结果。 Cu ads on humic acid的意思：Cu吸附在腐殖酸上; Cu ads on goethite的意思：Cu吸附在针铁矿上。
统计分析：
数据报告为每个处理组的一式三份的平均值plusmn;标准偏差（SD）。 采用单因素方差分析（ANOVA，SPSS Version 16.0，SPSS Inc.），然
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