壳聚糖及其衍生物接枝多肽的 制备及其性能研究外文翻译资料

 2022-07-18 07:07

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壳聚糖及其衍生物接枝多肽的

制备及其性能研究

摘要: 以微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）为生物催化剂，制备了胶原蛋白接枝壳聚糖，具有高效，选择性好，反应条件温和，环境友好等特点。优化了影响取代度（DS）的反应条件，包括反应时间，反应温度，胶原与壳聚糖的质量比以及MTGase与壳聚糖的质量比。在这项研究中，水溶性胶原蛋白 - 壳聚糖不仅可以减少水分的流失，还可以吸收水分。吸湿和保湿能力与DS值密切相关。另外，根据DS值和浓度评估体外抗氧化活性。此外，将L929小鼠成纤维细胞与胶原 - 壳聚糖一起培养，并且甲基噻唑四唑（MTT）测定显示DS为0.660的胶原 - 壳聚糖在2.5mg / ml显示出显着的细胞活力。因此，水溶性胶原 - 壳聚糖显示出在化妆品，生物医学和医药领域中修复皮肤的潜力。

简介：

皮肤是人体中表面积最大的动态综合器官。其老化，健康状况的变化，环境污染等因素可以使其正常功能逐渐降低。紫外线照射和烧伤还会干扰反应性氧物质形成与几种抗氧化剂体系之间的平衡。在高水平的氧化应激中，自由基与抗氧化防御系统之间的显着失衡可导致细胞损伤。过去几十年来，胶原蛋白，蚕丝和壳聚糖等天然生物材料在食品，化妆品，由于其独特的性能，如可生物降解性，生物相容性和无毒性，因此可用于生物医学和制药领域。据报道，一些天然的多糖 - 碳化物和肽具有促进细胞附着，增殖和组织再生的能力。

以独特的三螺旋结构为特征的胶原蛋白是存在于所有多细胞动物中的细胞外基质的主要组分。胶原蛋白具有良好的生物降解性，生物相容性，抗氧化活性，对皮肤的可修复性以及弱免疫原性反应。胶原蛋白在化妆品行业中被广泛用作保水剂和保湿剂。近年来，鱼类胶原蛋白的利用率很高，因为它具有高度的可用性，并且可以降低疾病传播的可能性。因此，鱼鳞胶原蛋白被认为是创伤愈合中应用最多的生物材料之一。

壳聚糖是一种天然的亲水性生物大分子，在甲壳类中大量存在。在结构上，它是线性（1-4）-2-氨基-2-脱氧-beta;-D-葡聚糖，随机乙酰化程度较小。由于生物相容性，生物降解性，抗菌活性，以及​​在伤口愈合过程中特有的生物学特性，壳聚糖作为纯天然的阳离子多糖，吸引了研究者的注意。然而，由于稳定​​的晶体结构，壳聚糖在pH 7以上通常不溶于水溶液。因此提高壳聚糖的溶解度是其开发应用的关键步骤。聚乙二醇接枝，羟基化，磺化，季铵化和羧甲基化是改性壳聚糖的常用方法，但化学交联剂经常会产生毒副作用（由于残留物）或与不需要的产物进行二次反应。与1-乙基 - （二甲基氨基丙基）碳化二亚胺和N-羟基磺基琥珀酰亚胺交联法相比，酶催化反应时间明显缩短，产物取代度（DS）较高。因此，人们非常关注酶催化反应以修饰壳聚糖。酶催化反应显示出多种益处，包括高效率，选择性，温和反应条件和环境友好性。

作为一种生物催化剂，微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）是一种具有钙依赖性催化特性的显着特征的胞外酶，此外，在广泛的温度和pH值范围内，它还具有广泛的底物特异性。 MTGase用于催化蛋白质的大分子移植和交联。它催化肽结合的谷氨酰胺残基的alpha;-羧基酰胺基团和赖氨酸的alpha;-氨基或多个组分的伯氨基之间形成共价键。为了整合双方的优势，研究人员尝试将壳聚糖与各种蛋白质或多肽结合。

本论文以MTGase为生物催化剂合成了胶原 - 壳聚糖，并对反应条件进行了优化。然后在不同的湿度下测量吸湿和保留的能力。根据过氧化氢清除活性和DPPH自由基清除活性讨论胶原 - 壳聚糖的抗氧化活性。此外，研究了胶原 - 壳聚糖对L929成纤维细胞增殖的影响。

2。材料和方法

2.1。物料

具有92％脱乙酰度的壳聚糖（Mw520,000）由Golden-Bell（Cochin，India）提供。鱼鳞胶原蛋白（Mw 3000）购自中国四川的四川明郎生物技术有限公司，无需进一步纯化。来自Streptoverticillium mobaraensis的微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）购自中国武汉的华生生物技术有限公司。 Dubecco的改良伊格尔培养基（DMEM）购自Thermo Co.Ltd。，北京，中国。来自中国浙江四季青有限公司的胎牛血清（FBS）。 Methylthiazol tetrazolium（MTT）购自Sigma，Deisenhofen，德国。本研究中使用的乙酸，氢氧化钠和其他试剂均为分析纯，无需进一步纯化。它们是从国药集团化学试剂公司

2.2。 MTGase的纯化

首先将MTGase倒入0.2mol / l Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4缓冲溶液（PBS，pH 5.0）中。将液体以3000rpm的速度离心10分钟。然后通过8000-10,000分子量的截止透析管透析3天使上清液纯化。将透析的MTGase冻干24小时以获得MTGase冻干粉末。

2.3。胶原 - 壳聚糖的制备

在典型的反应过程中，将壳聚糖（1g）溶于1％乙酸中并将溶液调节至pH6.0。将胶原蛋白（1g）溶解于PBS（0.2mol / L，pH6.0）中。然后将它们混合在一起形成均匀的溶液。此后，将MTGase粉末（0.1g）也溶解在PBS溶液中，然后将其加入到上述混合物中以催化壳聚糖和胶原之间的反应。磁力搅拌在40℃下持续1小时。然后将溶液在沸水中处理10分钟，然后冷却至室温。用定性滤纸过滤后得到胶原 - 壳聚糖溶液。随后，溶液用20％（w / w）NaOH水溶液中和，然后通过8000-10,000分子量截止透析管透析3天进行纯化​​。透析产物最后冷冻干燥以获得纯化的胶原 - 壳聚糖。将干燥的产品在P2O5中储存在真空干燥器中用于进一步分析。

2.4。单因素实验

研究了四个独立变量，包括反应时间（0.5,1-4h），反应温度（20-60℃），胶原与壳聚糖的质量比（0.6， 0.8,1.0,1.2和1.4）和MTGase与壳聚糖的质量比（0.06,0.10,0.14,0.18和0.22）。他们的变量固定在一定的数值​​，而只改变一个变量值。

2.5。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析

使用Nicolet 5700傅里叶变换红外光谱仪（USA）以400-4000cm-1的波数测定胶原 - 壳聚糖样品和壳聚糖的FT-IR光谱。通过KBr盘法制备样品。

2.6。测量取代度

取代度（DS）定义为每个壳聚糖重复结构单元取代的胺基团数目。在本研究中，根据Fan方法测量DS，胶原浓度在0.001g / l和0.05 g / l与UV分光光度计在200 nm处的吸光呈线度性关系。线性关系的标准曲线描述为公式（1）。壳聚糖和胶原 - 壳聚糖也用紫外分光光度法在200nm处测量吸光度浓度为0.05克/升。壳聚糖样品是空白对照。胶原 - 壳聚糖的DS值分别为由方程式（2）确定。。

A = 34.05C 0.030 R2 = 0.994 (1)

DS = 1526.45C 150 minus; 2999C (2)

其中A是胶原蛋白的吸光度，C是胶原蛋白的浓度。

2.7。水溶性测试

在室温下在不同pH值下测量胶原 - 壳聚糖的溶解度。简言之，将样品溶解于0.25％乙酸溶液（2mg / mL）中，使用NaOH调节溶液的pH值，并将溶液的透光率在在紫外分光光度计上记录600nm作为pH的函数。当透射率小于90％时，与蒸馏水相比，样品被认为是不溶的。

2.8。吸湿性和保留性测试

在吸湿性测试之前，将样品在P 2 O 5上真空干燥24小时。通过干样品重量增加百分比（Ra）评估吸水能力：

Ra(%) = （Wn minus; W0）/ W0 times; 100

其中W0和Wn是样品在20℃下放入饱和（NH4）2SO4干燥器（81％相对湿度）和饱和K2CO3干燥器（43％相对湿度）之前和之后的重量，时间为48小时。

在保湿性测试中，通过向每个样品添加10％的水制备湿样品。通过湿样品的残留水百分比来评价保湿能力

Rh(%) = Hn/ H0 times; 100

其中H0和Hn是样品在加入硅胶之前和之后在20℃的饱和K 2 CO 3干燥器（RH 43％）中48小时的重量。

2.9。抗氧化性能

2.9.1。过氧化氢清除活性

将1.0ml样品与6.0ml PBS溶液（0.1mol / l，pH7.4）和1.0ml 40mmol / l H 2 O 2混合。 10分钟后，用UV分光光度计在230nm处测量混合物的吸光度。并使用抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。

根据以下等式计算表达为H 2 O 2抑制百分比的样品的H 2 O 2清除活性：

H2O2清除率（％）=(1 minus; (As minus; Ab))/ Actimes; 100

其中As是样品的吸光度值; Ab是不含H2O2的空白样品的吸光度值; Ac是没有胶原 - 壳聚糖的对照样品的吸光度值。

2.9.2。 DPPH自由基清除活性

将样品与无水乙醇中的0.1mM DPPH以1：1v / v混合。在25℃黑暗中孵育30分钟后，通过用紫外分光光度计测量517nm处的吸光度来确定DPPH自由基的减少。使用抗坏血酸（Vc）作为阳性对照。 DPPH自由基清除活性的胶原 - 壳聚糖根据下式计算：

DPPH清除率=(1 minus; (Ds minus; Db))/ Dctimes; 100

其中Ds是样品的吸光度值; Db是没有DPPH的空白样品的吸光度值; Dc是没有胶原 - 壳聚糖的对照样品的吸光度值。

2.10。小鼠成纤维细胞系L929的细胞培养

将小鼠结缔组织成纤维细胞细胞系L929在补充有10％胎牛血清（FBS）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养。将细胞在37℃培养在5％CO2培养箱中，培养基每2天更新一次。当它们达到充血状态时，使用0.25％胰蛋白酶收获细胞。然后加入新鲜的培养基

2.11。 MTT测定

通过MTT测定检查细胞活力。简而言之，将每孔6000个细胞的密度的L929细胞接种到补充有DMEM的96孔微量滴定板中

含10％FBS。温育24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞并加入新鲜培养基。然后将通过具有不同参数的PBS溶解的样品加入到每个孔中。加入相同体积PBS的细胞作为对照组。温育22小时后，用PBS洗涤培养物两次并更换培养基。然后将MTT溶液（PBS中5 mg / ml）加入到每个孔中，并将平板在37°C孵育4 h，随后除去培养基并向每个壁中加入二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲crystals晶体。振荡约10分钟后，可溶性溶液变得均匀。使用酶标仪测量492nm处的光密度（OD）。通过以下等式计算细胞存活率：

细胞活力（％）= ODsample / ODcontroltimes; 100

其中ODsample是在胶原 - 壳聚糖存在的测量值，ODcontrol是在胶原 - 壳聚糖不存在情况下的测量值

3。结果与讨论

3.1。 FT-IR光谱学

壳聚糖和胶原 - 壳聚糖的FT-IR光谱如图1所示。它显示了1652cm-1（CO拉伸），1598cm-1（NH弯曲），1382cm-1（CH弯曲） ，1151 cm-1（桥O伸缩）和1091 cm-1（CO伸缩）对壳聚糖红外光谱的影响。显然，在胶原 - 壳聚糖的光谱中观察到1654cm-1和1545cm-1处典型的酰胺I和II谱带。它表明在NH 2上形成酰胺键。傅里叶变换红外光谱证实了壳聚糖与胶原蛋白的修饰。

3.2。合成胶原 - 壳聚糖反应条件的优化

3.2.1。反应时间对取代度的影响

图2（a）显示，当反应时间从0.5h增加到1h时，胶原 - 壳聚糖的DS从0.567增加到0.660。然而，随着反应时间从1h增加到4h，取代度急剧增加降至0.318。这可以解释如下：在第一阶段，较长的反应持续时间增加了壳聚糖和胶原扩散到MTGase活性中心的速度。在1h时底物被底物饱和，取代度达到最高水平。然而，可逆反应随着反应的进一步延长而加速。并且中间体与H2O反应而不是胶原。这导致取代度显着下降。因此，揭示最佳时间为1小时，最高水平为取代度0.660。

3.2.2。反应温度对取代度的影响

如图2（b）所示，取代度在20-40℃之间从0.486增加到0.660，然后在40◦C下降到0.425。可以看出，温度影响这些分子的运动。因此，随着温度的升高，反应物的活性和反应速率逐渐加快。然而，当达到温度时，由于在较高温度下酶失活，DS随着温度的进一步升高而降低。而且由于酶催化反应是放热反应，所以可逆反应加速。所以最佳温度是40℃。

3.2.3。胶原蛋白与壳聚糖质量比对取代度的影响

根据图2（c），取代度以0.6和1.0之间的比例增加。在更高的比例下，取代度有轻微减少的趋势。从酶催化反应方程可以看出，这可能是由于大分子壳聚糖与胶原之间的立体隐形效应和静电斥力的结果。而当胶原与壳聚糖的质量比超过1.0时，则缺乏胺基。 MTGase催化谷氨酰胺酰残基的alpha;-羧酰胺基团的水解，导致脱酰胺作用。因此质量比的进一步增加对取代度有一定的影响。综合考虑，胶原蛋白与壳聚糖的最佳质量比为1.0。

3.2.4。 MTGase与壳聚糖质量比对取代度的影响

图2（d）描述了MTGase与壳聚糖质量比对取代度的影响。如所呈现的，随着MTGase与壳聚糖的质量比增加，DS值增加至0.660。然而，随着MTGase的进一步增加，取代度急剧下降。这可以解释为这种结果：含赖氨酸的肽充当酰基受体，并且它们也可以充当酰基受体。超级MTGase可以催化胶原蛋白和胶原蛋白之间的反应。所以过多的MTGase会对反应产生副作用。因此，MTGase与壳聚糖的最佳质量比约为0.1。

3.3。胶原 - 壳

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