壳聚糖 – 明胶抗菌共聚物的酶法合成及其表征外文翻译资料

 2022-09-30 11:09

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壳聚糖 - 明胶抗菌共聚物的酶法合成及其表征

摘要：希夫碱可以在催化剂作用下通过酰氨与微生物转谷氨酰胺酶（TG酶）的氨基之间的反应来形成，并在食品工业中与蛋白质的交联使用。一种肉质涂层的新型壳聚糖 - 明胶共聚物可以使用转谷氨酰胺酶作为催化剂来合成，兼具壳聚糖和明胶的特性。本研究的目的是合成和表征壳聚糖 - 明胶抗菌共聚物。

结果：共聚物的产率随明胶/壳聚糖比率增加，而由共聚物抑菌金黄色葡萄球菌座椅的降低，显示出它的抑菌能力取决于在脱乙酰壳多糖的氨基。在明胶/壳聚糖比率为0.6，50℃，pH为6和40分钟反应时间的最佳合成条件下共聚物率为64.5％。10g/kgminus;1共聚物溶液的金黄色葡萄球的抑菌方案是用70%的壳聚糖。

结论：具有优良的生物相容性和抗菌性能的新型生物敷料框架材料已成功制备。这项研究的结果提供了对在农业和食品领域的壳聚糖 - 明胶共聚物的潜在应用进一步调查的背景。

关键词：壳聚糖；明胶；共聚物； 转谷氨酰胺酶；抑菌作用

介绍

壳聚糖是一种通过beta;-1,4-糖苷键连接的葡萄糖单元组成的杂多糖。它具有生物相容性，可生物降解，无毒，可食用和作为抗菌剂被广泛用于营养增强和食品加工。一层保护壳聚糖膜表面上的肉可以减少蛋白质的氧化速率,显著抑制一些病原微生物的增长。然而,壳聚糖没有网络结构,和它的基本单元, 2-葡糖胺，非常不同于蛋白质氨基酸,所以它的凝聚力和天然气肉表面的屏障能力都差。明胶,水溶性的胶原蛋白,是一个线性聚合物具有优良的成膜性能。其氨基酸蛋白质氨基酸基本上是一样的,所以它有更好的生物相容性和强大的凝聚力。然而，明胶是氮微生物生长的良好来源，所以当单独使用明胶制成的薄膜时，细菌感染的可能性会增加。

最近，人们发现，混合壳聚糖 - 明胶薄膜可以克服上述缺点。洛佩斯·卡瓦列罗等应用壳聚糖和明胶溶液混合制成的树脂涂料，并研究了它的防腐效果。长滨等采用悬浮壳聚糖水凝胶明胶混合制成壳聚糖 - 明胶膜。但是壳聚糖或明胶的区域盲点可以形成为它们的显著差异的结果，这可以减少有效的涂层。另一方面，通过化学交联制备的壳聚糖 - 明胶聚合物的粘结性，稳定性和抑菌能力都较好，但交联剂可能影响其生物相容性和可降解的聚合物和它的残留物也可引起副作用。

希夫碱可以以转谷氨酰胺酶（一个从微生物得到的游离氨基转谷氨酰胺酶）为催化剂通过酰氨和微生物之间的反应来形成，并用于食品行业。转谷氨酰胺酶（TG酶，蛋白谷氨酰胺gamma;-谷氨酰转移酶，EC2.3.2.13）催化酰基转移反应，其中肽结合的gamma;羧酰胺基谷氨酰胺残基作为酰基供体。大多数常见转谷氨酰胺酶的酰基受体是赖氨酸残基的ε氨基基团肽和一些天然多胺的主要氨基酸组。尼奥等人报道,的解决方案几种蛋白质（alpha;S1酪蛋白和大豆11S和7S球蛋白）被转谷氨酰胺酶和凝胶依赖于蛋白质浓度牢固地形成。Chanyongvorakul等研究了明胶和11S球蛋白从大豆和催化蚕豆（豆球蛋白）钙独立性转谷氨酰胺酶的反应。

然而，在文献中关于用转谷氨酰胺酶作为催化剂合成壳聚糖 - 明胶共聚物的信息很少。本研究的目的是要优化为催化剂，壳聚糖和明胶作为底物合成壳聚糖 - 明胶共聚物的工艺条件及其物理和化学性质。大约20％的谷氨酰胺残基存在于明胶和约90％的游离氨基存在于壳聚糖，他们都是转谷氨酰胺酶的基质。一种新型共聚物涂层肉类产品可以用转谷氨酰胺酶作为催化剂来合成，兼具壳聚糖和明胶两者的特点。

材料和方法

化学药品

壳寡糖（MW~5000道尔顿，脱乙酰度90.32％）和明胶（Mw~3000道尔顿）购自玉环购生化有限公司（中国浙江）。溶菌酶（2500 U mgminus;1蛋白）,胰蛋白酶（2500 U mgminus;1蛋白质），牛血清白蛋白（BSA，生物试剂（BR）），3,5-二硝基水杨酸，钠双（2-乙基己基）磺基琥珀酸钠（AOT）和聚乙二醇（PEG，MW2times;10⁴道尔顿）购自国药生物有限公司（上海，中国）。透析膜（分子量截留（MWCO）8times;10sup3;-1times;10⁴道尔顿）和超滤膜（MWCO2times;10⁴道尔顿）购自乌尼昂生化有限公司（上海，中国）。金黄色葡萄球菌（BR），购自中西部公司（中国武汉）。其他使用试剂均为分析纯。

转谷氨酰胺酶的纯化和冻干粉的准备

转谷氨酰胺首先被倾入到0.2 moL.Lminus;1 KH2PO4 / K2HPO4缓冲液（pH 6.5），以获得0.16 U.mLminus;1 转谷氨酰胺活性初品。将液体在517times;g离心10分钟，并用HCL溶液将上清液的pH值调节至5.58。液体再次离心，将上清液调节至pH4.25。进一步离心后上清液在0.1MPa用渗析膜（截留分子量为2times;10⁴道尔顿）超滤。将超滤液用下0.05 mol.Lminus;1的AOT 提取20分钟，在21times;g下磁力搅拌并在802times;g下离心5分钟。重新提取提取液的上层相，与2 mol.Lminus;1的KCL等​​体积放置，再在21times;g下磁力搅拌萃取20分钟并萃取，在802times;g下离心5分钟。将提取物的下层相转移到透析袋（MWCO 8times;10sup3;道尔顿），并用蒸馏水透析12小时。小分子杂质的透析方法是在PEG（分子量2times;10⁴道尔顿）中透析一夜。最后，转谷氨酰胺酶在-50至-60℃和25-50Pa冷冻24小时以纯化和冻干。具体的冻干粉是88.21 U.mgminus;1蛋白。

壳聚糖 - 明胶共聚物溶液的制备

将20 g.kgminus;1壳聚糖溶解在0.1 mol/L的 Na2HPO4 /KH2PO4缓冲区(pH值6.1)与蒸馏水比率1:1(v/v)的20 g.kgminus;1明胶溶液混合并调整pH值至6。然后加入5.kgminus;1转谷氨酰胺酶到该混合溶液来催化壳聚糖和明胶之间的交联反应，在50℃反应40分钟。反应后的溶液先在沸水中处理10分钟，然后迅速冷却至-18至-25℃。最终将溶液过滤，贮存于4℃后获得壳聚糖 - 明胶共聚物。

壳聚糖 - 明胶共聚物的分离纯化

先将制备的壳聚糖 - 明胶共聚物溶液（pH 2.3）调整至pH 5，然后重复超滤直到没有壳聚糖或蛋白质出现在滤液中。超滤液用水透析12小时以除去乙酸，转移至透析袋中，并用PEG（分子量2times;10⁴道尔顿）浓缩，然后在-60℃冻干24小时。浅紫色的壳聚糖 - 明胶得到的共聚物贮存于4℃。

傅里叶变换红外光谱

傅里叶变换红外（FTIR）分析，用分光计550II（Nicolet公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）在室温下从2500至900cmminus;1进行扫描。壳聚糖，壳聚糖/明胶混合物和壳聚糖-明胶共聚物是分别加入KBr混合并用于测量板。

水解溶菌酶和胰蛋白酶

将溶菌酶或胰蛋白酶加入到10 g. kgminus;1的酶/共聚物比率为1：1000（V / V）壳聚糖-明胶共聚物溶液。将溶液在55plusmn;0.5℃搅拌60分钟并在517times;g离心10分钟。通过3,5-二硝基水杨酸测定法测定还原糖的上清液浓度，游离氨基的量由甲醛法和蛋白质的水解度确定，评估为(m1/m) times; 100%，其中m是蛋白质的总质量，m1是氨基在水解液中游离氨基的量。

体外抑菌

肉汤培养物用金黄色葡萄球菌接种。根据盘琼脂扩散（DAD）法，用10kg-1的壳聚糖 - 明胶共聚物溶液渗透纸片，然后附到在37℃培养箱培养24 h接种的培养物。

壳聚糖明胶共聚物的体外抑菌作用的效率是评估通过测量抑菌圈的直径:直径越大,抑菌作用越强。

pH，溶解度，分子量，蛋白质含量，共聚物

100毫升10g.kgminus;1的壳聚糖 - 明胶共聚物溶液置于一个反应器中，并在21times;g和20plusmn;0.5摄氏度下磁力搅拌。然后加入10g.kg-1 Na​​OH溶液滴加直到系统形成的凝胶。随后加入100毫升蒸馏水分散凝胶。最后，将用酸度计测定系统pH。

20毫升pH值为5的盐酸溶液的和0.5--2.5 g 壳聚糖明胶共聚物放置在一个反应器, 在21times;g 和20plusmn;0.5 摄氏度下磁力搅拌5 h并真空过滤1 h。最后,60℃干燥后的计算溶解度。

分子量用塞法戴克斯凝胶渗透色谱（GPC）BSA（Mr67 000），鸡卵清蛋白（Mr43 000）和碳酸酐酶（Mr29 000）作为壳聚糖 - 明胶共聚物的蛋白质测定标准。洗脱曲线是绘制体积为横坐标和在280nm处吸光度作为纵坐标。该相对分子量由壳聚糖 - 明胶共聚物溶液的洗脱体积估计。

蛋白质含量是由缩二脲法确定。标准曲线以BSA浓度为横坐标和在540nm的吸收波作为纵坐标绘制。壳聚糖 - 明胶中的蛋白质含量由共聚物溶液的吸收值估计。

共聚物产率

共聚物产率计算公式为：[m/(m1 m2)] times; 100%，其中，m1，m2是壳聚糖和明胶，m是壳聚糖 - 明胶共聚物的量（g）。

图1 壳聚糖-明胶聚合物的合成催化

图2 反应时间对共聚物产量的影响 图3 温度对共聚物产量的影响

图4 pH值对共聚物产量的影响

结果和讨论

壳聚糖-明胶共聚物的最佳反应条件

壳聚糖-明胶共聚物的制备方法如图。壳聚糖 - 明胶共聚物与席夫碱酰氨交联混合并以转谷氨酰胺酶作为催化剂与之间的氨基反应之后形成。大约有20％的谷氨酰胺存在于明胶和约90％的游离氨基酸存在于壳聚糖中。它们可与转谷氨酰胺酶催化剂交联。

图2显示了平衡曲线明胶/壳聚糖比为0.6合成共聚物的平衡曲线。可以看出，0和40分钟之间的共聚物的产率和反应时间成正比，在此之后，反应达到平衡。壳聚糖 - 明胶共聚物合成包括三个步骤：

（1）脱乙酰壳多糖和明胶扩散到转谷氨酰胺酶的活性中心；

（2）共聚物形成的酶作为催化剂；

（3）共聚物从催化剂离去。

控制步骤是基质扩散到酶中心的速度。此外, 从0到40分钟,基质扩散到中心数量的增加逐渐，产量也不断增加。然而，在40分钟，酶与基质变得饱和，表观产率最高。

温度对共聚物的产量的影响见图3。可以看出，在30℃和50℃之间时产率与温度成正比，但高于50℃后成反比。温度影响分子的运动，因此，该反应起初随温度上升而加速。当达到最佳温度，因酶变性的结果使得反应速度在更高温度下随温度进一步增加而减少。

pH值对共聚物的产率的影响如图4所示。可以看出,pH值4和6之间的产率增加然后pH值6以上减少。pH值影响底物和酶的分解,因此他们的组合,最终影响产量。

因此复合酶与底物之间形成确实达到最佳点,和相应的最高速度。上述结果表明，该最佳合成条件为50℃，pH为6和40分钟的反应时间，导致达到平衡的共聚物的产率是64.5％。

壳聚糖-明胶共聚物的红外特性描述

壳聚糖，壳聚糖/明胶混合物和壳聚糖 - 明胶共聚物的IR光谱示于图5。

由此可以看出，壳聚糖和壳聚糖/明胶混合物的光谱不是显著不同。这是因为壳聚糖和明胶混合物中仅物理地结合起来，所以该混合物只是比壳聚糖包括多个IR吸收的氨基和羧基组。

图5(a)壳聚糖-明胶共聚物、(b)壳聚糖/ 明胶混合物和(c)壳聚糖的红外光谱

吸收的游离氨基和羧基基团混合物在1680 cmminus;1显示IR。然而，席夫碱在共聚物的伸缩振动与这些游离氨基和羧基基团的吸收重叠，所以1680 cmminus;1的红外吸收得到加强。另一方面，游离氨基的一部分被用于合成席夫碱，这导致在1080及1380cm-1吸收的削弱。

因此壳聚糖，壳聚糖/明胶混合物和壳聚糖 - 明胶共聚物的红外光谱的显示比较，由于席夫碱在1680 cmminus;1的吸收更强和更清晰的，而氨基信号在1080及1380cm-1较弱。这些结果表明，希夫碱与转谷氨酰胺酶形成为催化剂。

图6 壳聚糖 - 明胶共聚物的TGA/ DTA曲线

图7 壳聚糖的TGA/ DTA曲线

热重/差热分析　　壳聚糖-明胶共聚物(TGA / DTA)描述

壳聚糖 - 明胶共聚物的TGA/ DTA曲线（图6）与壳聚糖（图7）和明胶（图8）的比较，可以看出，该共聚物具有大约相同的吸附水的损失温度（76.85℃）和融化温度（228.54℃），确认该共聚物是由壳聚糖和明胶这两个基板构成。壳聚糖的一部分游离氨基和酰胺基以转谷氨酰胺酶作为催化剂反应，使该共聚物的两个新的峰出现在大约566和660℃。前者是由于希夫碱的熔融转变，而后者是由席夫键的断裂而引起的。它是比游离氨基的两个基质的吸热熔化峰（~544℃）高20℃比吸热分解峰（~600℃）60℃更高。因此，壳聚糖 - 明胶共聚物通过席夫碱交联。

图6中在76.85℃吸热峰对应于吸附水损失，在228.54℃峰值对应融化，并在约566和660℃的新峰分别对应的席夫碱和断裂希夫键的熔融转变。与那些共聚物的相比，游离氨基壳聚糖（图7）和明胶的熔融转变峰（图8）都在约544℃和分解峰都在约600℃，从而确认壳聚糖和明胶之间形成的是席夫键。

图8 明胶的TGA/ DTA曲线

壳聚糖-明胶共聚物的原子力显微镜（AFM）观察

明胶和壳聚糖是直链聚合物。壳聚糖的基本单元是直径0.25〜0.45纳米的葡糖胺残基。明胶由直径0.15-0.25纳米的氨基酸残基组成。脱乙酰壳多糖 - 明胶共聚物示出了具有直径0.15-0.45纳米的颗粒的分支状结构，这些直径0.25〜0.45 nm的是葡糖胺残基组成。这可以归因于游离氨基壳聚糖和酰氨明胶之间形成席夫键与以转谷氨酰胺酶作为催化剂。

壳聚糖 - 明胶共聚

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