壳聚糖及其衍生物接枝多肽的制备及其性能研究外文翻译资料

 2022-09-30 11:09

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壳聚糖及其衍生物接枝多肽的制备及其性能研究

摘 要

以转谷氨酰胺酶为催化剂，催化胶原蛋白肽分子链以酰胺键接枝到壳聚糖骨架上，在水相中制备壳聚糖-胶原蛋白肽。产物具有很高的活性、选择性、温和的反应条件以及对环境友好的性质。对反应时间、反应温度以及质量比这些会影响产品取代度的因素进行优化。吸湿保湿性实验结果表明产物不仅可以减少水分的损失还可以有效进行对水分进行吸收。随着取代度的增加，壳聚糖-胶原蛋白肽的吸湿率和保湿率也随之增大。另外，还进行了对取代度和浓度这两个因素进行体外抗氧化实验。对L929成纤维细胞存活率实验结果表明当浓度为2.5 mg/ml，取代度为0.660时，壳聚糖-胶原蛋白肽具有很好的细胞存活率。因此，水溶性的壳聚糖-胶原蛋白肽显示出了在化妆品、生物医学和制药领域修复皮肤的潜在应用价值。

1.引言

皮肤作为人体最大的器官，覆盖在身体表面。其正常的功能会随着年龄、健康状况、环境污染和伤口而受到削弱。紫外照射和烧伤活也会对性氧的形成和抗氧化系统的功能在很多方面造成干扰。在高度的氧化应激下，自由基和抗氧化防御系统之间存在的的重大失衡会导致细胞损伤。在过去的几十年里,胶原蛋白、蚕丝和壳聚糖等天然生物材料，因其独特的属性,如生物降解性、生物相容性和无毒性，在食品、生物医学和制药领域受到了越来越多的关注。有报道称,一些天然多糖和多肽促进细胞附着， 增殖和组织再生的能力。

胶原蛋白是一种以一种独特的三股螺旋结构结构存在于所有多细胞动物细胞外基质的物质。胶原蛋白具有良好的生物降解性,生物相容性,抗氧化活性,修复肌肤的能力,和弱免疫原性反应。胶原蛋白是广泛使用在化妆品行业的保水剂和保湿剂。最近,鱼类胶原蛋白受到广泛的关注,因为其具有很高可用性，可能有助于减少疾病的传播。因此,鱼鳞胶原蛋白被公认为是在伤口愈合运用方面最有前途的生物材料。

壳聚糖是一种在甲壳类动物中大量存在的一种天然的亲水性生物大分子。当随机乙酰化到一个较小的程度时，其结构是 (1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-beta;-D-葡萄糖。作为在自然界中存在的唯一的阳离子多糖,因为其在伤口愈合方面具有生物相容性,生物降解能力,抗菌活性和独特的生物属性，壳聚糖吸引了研究者的注意。然而, 因为稳定的晶体结构壳聚糖通常不溶于pH值7以上的溶液中。 因提高壳聚糖的溶解性是拓展其应用的关键一步。羧甲基化、烷基化、季胺化、酰基化等化学反应是改性壳聚糖的常用方法。然而,化学交联剂因为存在残余试剂或者二级反应会经常产生有副作用的一面，从而得到不想要的产品。与化学交联方法相比较，酶催化反应时间会明显缩短，产物的取代度会更高。因此，研究者有极大的兴趣致力于关注酶催化反应改性壳聚糖。酶催化反应显示出各种各样的好处,包括高活性、选择性、温和的反应条件和环境友好性质。

作为一种生物催化剂，转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转移反应的酶，其通过异肽键来催化蛋白质或多肽间发生酰基转移反应，并形成的共价键。其显示了广泛的底物特异性，在大范围的温度和pH值内都可以保持很高的活性。

本课题以微生物转谷氨酰胺酶为催化剂，将胶原蛋白肽分子链接枝到壳聚糖氨基上，并优化了反应条件。测量了不同取代度、浓度的壳聚糖-胶原蛋白肽的吸湿保湿性；不同取代度、浓度的壳聚糖-胶原蛋白肽对过氧化氢、DPPH清除率的影响；以及不同取代度、浓度的壳聚糖-胶原蛋白肽对成纤维细胞存活率的影响。

2.材料和制备方式

2.1材料

脱乙酰率为92%的壳聚糖(Mw520000)是由印度的the Golden-Bell公司提供的。鱼鳞胶原蛋白(Mw3000)是从四川铭让生物科技有限公司购买的，没有进一步纯化。由轮枝链霉菌产生的微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)是从武汉华顺生物技术有限公司购买的。乙酸、氢氧化钠和其他用于实验的试剂均为分析纯，没有进一步净化，并且都是购自国药控股集团化学试剂集团。

2.2.MTGase的纯化

配制0.2 mol/l Na2HPO4/NaH2PO4缓冲溶液（PBS，pH 5.0），将一定量的粗MTGase粉溶解在PBS缓冲溶液中，3000转/分离心10 min后，收集上层清液，并将上层清液真空抽滤两次。将滤液透析三天后，经冷冻干燥得到MTGase冻干粉，在4℃下保存备用。

2.3壳聚糖-胶原蛋白肽的制备

量取50 ml 1%的醋酸溶液至三口烧瓶中，加入1.0 g壳聚糖，搅拌使其充分溶解，并用醋酸溶液和氢氧化钠溶液调节其pH值至6.0。随后，称取1.0 g 胶原蛋白肽，将其溶解在50 ml PBS缓冲溶液中，同样，称取0.1 g MTGase冻干粉，将其溶解在50 ml PBS 缓冲溶液中。在40 oC下，依次向三口烧瓶中加入胶原蛋白肽溶液和MTGase溶液，磁力搅拌1 h后，将反应液至于沸水浴中搅拌10 min使酶失活，然后将反应液冷却至室温。经真空抽滤后，将滤液用20% NaOH溶液调pH至中性，滤液透析三天纯化，冷冻干燥后得到壳聚糖-胶原蛋白肽冻干粉。反应如图2-1。采用单因素实验法，控制反应时间(t：0.5-4 h)、反应温度（T：20-60 oC）、胶原蛋白肽和壳聚糖的质量比（mCOP/mCS ：0.6-1.4）、MTGase和壳聚糖的质量比（mMTGase/mCS ：0.06-0.22）得到不同取代度的壳聚糖接枝胶原蛋白肽。

2.4 单因素实验

对四个独立变量进行探索,包括反应时间(0.5,1-4 h),反应温度(20--60℃),胶原蛋白与壳聚糖的质量比(0.6,0.8,1.0,1.2和1.4)和MTGase与壳聚糖的质量比(0.06,0.10,0.14,0.18和0.22)。将所有变量固定在一定的数值,而只改变一个变量的值。

2.5壳聚糖-胶原蛋白肽的红外表征

将壳聚糖及壳聚糖-胶原蛋白肽样品研碎后，在50 oC的恒温干燥箱中干燥24h以上。采用溴化钾压片法，制成薄膜圆片，傅里叶变换红外光谱仪在波长范围为400-4000 cm-1内对壳聚糖及壳聚糖-胶原蛋白肽样品的薄膜圆片样品进行扫描，即得到壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白肽样品的傅里叶红外光谱图。

2.6壳聚糖-胶原蛋白肽取代度的测定

采用紫外分光光度法对壳聚糖-胶原蛋白肽样品的取代度（DS）进行计算测定[48]。将精确称取的一定质量的胶原蛋白肽溶解于蒸馏水中，配制浓度为0.001 g/l、0.005 g/l、0.01 g/l 、0.025 g/l和0.05 g/l的胶原蛋白肽溶液。然后用紫外分光光度计测定不同浓度胶原蛋白肽溶液在固定波长为200 nm处的吸光度。得到所测浓度与吸光度成线性关系，如公式（2-1）。 称取一定量壳聚糖及不同取代度的壳聚糖-胶原蛋白肽样品，精确配制成浓度为0.05 g/l的溶液，并用紫外分光光度计测定其在固定波长为200 nm处的吸光度，壳聚糖溶液为空白对照组。根据浓度和吸光度之间的关系，利用公式（2-2）计算壳聚糖-胶原蛋白肽的取代度。

公式（2-1）

公式（2-2）

2.7水溶性测试

壳聚糖-胶原蛋白肽的溶解度是在室温下在不同的pH值下测量的。将样品溶解在0.25%醋酸溶液(2mg/ml)，溶液的pH值通过使用氢氧化钠调整，使用紫外分光光度计在600 nm处记录溶液的透过率。与蒸馏水作对照，当透光率不到90%时，样品被认为是不溶的。

2.8壳聚糖-胶原蛋白肽吸湿保湿性能的测定[49]

2.8.1 壳聚糖-胶原蛋白肽吸湿性能的测定

称取一定量的壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白肽样品各两份，在恒温烘箱中干燥24 h后，分别平铺放入直径为3 cm的称量瓶中，将称量瓶分别放置在两个干燥器中，一个干燥器中放一定量饱和的硫酸铵溶液（相对湿度为RH=81%），另一个干燥器中放一定量饱和的碳酸钠溶液（相对湿度为RH=43%），放置时间为48 h。分别称量壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白肽样品放置前的质量（Wo）和放置后的质量（Wn）。按公式（2-3）计算其吸湿率：

公式（2-3）

2.8.2 壳聚糖-胶原蛋白肽保湿性能的测定

称取一定量的壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白肽样品，在恒温烘箱中干燥24 h后，分别平铺放入直径为3 cm的称量瓶中，加入质量分数为样品量10%的蒸馏水，将称量瓶分别放置在装有干硅胶的干燥器内，放置时间为48 h。分别称量壳聚糖和壳聚糖-胶原蛋白肽样品放置前的质量（Ho）和放置后的质量（Hn）。按公式（2-4）计算

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