汉族人群中胱硫醚β-合酶基因启动子的功能变异会显著降低先天性心脏病的易感性外文翻译资料

 2022-04-29 09:04

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汉族人群中胱硫醚beta;-合酶基因启动子的功能变异会显著降低先天性心脏病的易感性

摘要：

对于各种心血管疾病而言，同型半胱氨酸是一种独立的风险因子。有两种方法可从胚胎心脏细胞中去除同型半胱氨酸：再甲基化形成甲硫氨酸或转硫化形成半胱氨酸。胱硫醚beta;-合成酶（CBS）作为限速酶催化同型半胱氨酸转硫的第一步。在这项研究中，我们在CBS基因启动子区发现了一个功能性的变异-4673Cgt; G（rs2850144），这一变异显著降低了由2 340例CHD患者和2 270例对照组成的汉族人群先天性心脏病（CHD）的易感性。携带杂合CG和纯合GG变异基因型的个体与联合样本中野生型CC基因型的携带者相比，患CHD的风险分别降低了15%（优势比（OR）= 0.85,95％置信区间（CI）= 0.75-0.96，P = 0.011）和40%（OR = 0.60,95％CI = 0.49-0.73，P = 1.78times;10-7）。额外的分层分析表明CBS的这个位点与分隔缺陷和圆锥动脉缺陷显著相关。体内检测人心脏组织中的CBS mRNA水平以及体外荧光素酶的测定，结果一致表明，次要的G等位基因会显著增加CBS的转录。功能分析显示，转录抑制子SP1结合亲和力的减弱和与次要G等位基因特异性连接的CBS启动子的低甲基化均有助于显著上调CBS的表达。因此，具有遗传上增加CBS表达的个体将受益于这种保护，这是由于在心脏发育的关键时期，在特定的细胞中由CBS维持的低同型半胱氨酸水平。这些结果揭示了CBS出乎意料的作用，并强调了心脏发育中同型半胱氨酸去除的重要性。

关键词：

先天性心脏病，胱硫醚beta;-合成酶，非编码变异体，同型半胱氨酸

介绍：

先天性心脏病（CHD）是最常见的出生缺陷，全世界每千名活产婴儿中就有9.1人患CHD。中国CHD的患病率正在上升。CHD的病因复杂，既有遗传因素，也有环境因素。数十年的流行病学研究表明，孕前叶酸治疗可以保护新生儿免受各种先天性异常的影响，其中包括将CHD风险降低40％-60％。因此，关于叶酸代谢途径中基因的遗传传变异和CHD风险的关联研究开始兴起，特别是深入研究的MTHFR C677T基因。然而，这些研究产生了具有争议的结果。

作为叶酸途径中的代谢物，同型半胱氨酸可被叶酸补充从而反向调节，并且是CHD的独立风险因子。母亲同型半胱氨酸水平升高与后代CHD风险增加有关。小鼠和鸡胚胎研究表明，在心脏发育的关键时期暴露于外源性同型半胱氨酸会增加CHD的发病率，尤其是分隔缺陷。我们以前的研究发现了甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）基因中的第一个内含子c.56 781Agt; C的功能变异，它显著增加了汉族人群大规模病例对照研究中患CHD的风险。 MTRR是甲硫氨酸合酶（MTR）的活化所必需的，MTR催化同型半胱氨酸重新甲基化为甲硫氨酸。这一结果强烈支持了这一假说，即同型半胱氨酸的去除对于胚胎心脏发育至关重要，因为MTR / MTRR活性对同型半胱氨酸的充分再甲基化至关重要。除了被甲硫氨酸重新甲基化之外，胚胎细胞中的同型半胱氨酸可以通过转硫途径去除以形成半胱氨酸。胱硫醚beta;-合成酶（CBS）在转硫途径中催化从同型半胱氨酸到胱硫醚的第一个不可逆的步骤。

CBS基因位于人类染色体21q22.3上。 CBS缺陷是经典高胱氨酸尿症（HCU，OMIM236200），一种遗传性常染色体隐性遗传代谢性疾病的最常见原因。尽管与成人相比，CBS在胎儿中呈现低水平，但其表达集中在神经和心脏组织中，尤其是在心内膜细胞中，这意味着CBS在胚胎心脏发育中有潜在的功能。少数关注CBS编码区变异和冠心病风险的关联研究获得了阴性结果。

在这项研究中，CBS基因中的非编码变异体在3个独立的来自汉族人群的病例对照中进行研究，其中CHD患者2 340例，对照2 270例。我们鉴定了CBS启动子变体-4673Cgt; G（rs2850144，NC_ 000021.8：g44496976Cgt; G），它在三个病例 - 对照组和组合数据中增加CBS基因表达并且与降低CHD的风险显著相关。

结果

CBS 5#39;端的调节变体-4673Cgt; G显著降低CHD的风险

CBS基因跨越30kb，由23个外显子组成。 人类CBS基因编码不同的mRNAs，这是使用五种可选的非编码外显子（指定为-1a至-1e）和恒定外显子0的结果。含有外显子-1a或-1b的转录物似乎是最丰富的并且是在各种成人和胎儿组织中都有发现。 然而，使用外显子-1c，-1d和-1e似乎很少。 在这项研究中，检测区域覆盖了第一个外显子1a上游的CBS 5#39;调控区（-6 251至-3 623，从ATG编号）以及整个3#39;UTR片段（图1A）。

在CBS基因的调控区总共发现了3个常见的单核苷酸多态性，其次要等位基因频率gt; 0.1，包括启动子上的rs2850144（ATG -4673位点NC_000021.8：g44496976Cgt; G，-4673Cgt; G位点）和3#39;UTR区域的rs1051319， rs706208位点。

在关联研究的第一阶段，我们对上海组的270个病例对比552个对照中的3个SNPs进行了基因分型。仅有一个SNP（-4673Cgt; G，rs2850144）的基因型分布在病例组和对照组之间有显著差异。 -4673位点的次要等位基因G与CHD风险降低有关。在山东组259例病例对比324例对照的验证研究中观察到类似的结果（补充信息，表S1）。目前尚未报道CBS启动子中的变异-4673Cgt; G与任何疾病有关。为了进一步验证等位基因G在-4673位点的保护作用，我们进行了一项第二阶段的关联研究，将样本量扩大到上海组的602例病例和660例对照，山东组的735例病例和564例对照。此外，还增加了来自江苏的1 003个病例和1 046个对照样本进行验证。

我们发现在上海组和山东组中，-4673G等位基因与C等位基因相比，对CHD的保护作用。在独立验证的江苏组中，观察到与山东和上海组类似的结果（每个等位基因调整OR = 0.82,95％CI = 0.72-0.93，P = 0.002）（表1）。所有基因型频率均符合对照组的哈迪温伯格期望值（Pgt; 0.05）。

与CC基因型相比，三种组合的样本产生-4673G等位基因的CHD风险降低20％，CG基因型的CHD风险降低15％，GG基因型的CHD风险降低40％

我们检查了不同种族群体中CBS -4673位点的SNP频率（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2850144）。 CBS -4673位点不同种族人群的等位基因频率显著不同。有趣的是，非洲的保护性G等位基因比在欧洲或亚洲更为丰富，而据报道，与欧洲相比，非洲的CHD分娩率（每千例活产婴儿1.9个）为最低，与欧洲（每千名活产婴儿8.2个）和亚洲（每千名活产中有9.3人）相比。

在同一组群中，MTRR基因中的非编码变体c.56 781Agt; C与CHD显著相关。因此，通过逻辑回归模型和PLINK中的上位性分析来查询CBS（-4673Cgt; G）和MTRR（c.56 781Agt; C）之间可能的基因 - 基因相互作用。然而，在加性模型，隐性模型，显性模型或基因型模型中，这两个变体之间PLINK上位分析没有观察到任何相互作用。

CBS -4673Cgt; G与分隔缺陷和圆锥动脉心脏疾病密切相关

根据CHD标准分类，对-4673Cgt; G进行了分层分析。 对于分隔缺陷（1 652例，P = 1.29times;10-6）和圆锥角膜缺陷（386例，P = 0.002）观察到最显著的保护作用（表2）。 此外，在分组的CHD中，我们观察到CBS -4673Cgt; G与室间隔缺损（VSD，1 220例，P = 3.18times;10-5），房间隔缺损（ASD，235例，P = 0.0006）和法洛四联症（TOF，291例，P = 0.0016）显著相关。

这些受影响的CHD亚类与人类和小鼠胚胎中的CBS表达模式高度一致。 CBS mRNA在36天龄的人胚胎（CS15）中在心内膜细胞中被观察到，并且另外在来自形成圆孔壁心肌壁的神经嵴的细胞中被发现。然后，CBS mRNA在心内膜组织以及后期的心房和心室心肌壁中可检测到。在小鼠心血管系统中，在心内膜细胞中从E12.5可以额外检测到CBS表达。

同时，非综合征型隔离的CHD与CBS -4673Cgt; G多态性（2 025例，P = 3.2times;10-7）显著相关，而未分离型的CHD则未发现（315例，P = 0.25）。

-4673Cgt; G变体增加CBS转录活性

由于相关多态性位于CBS基因的启动子区域，我们推测它可能影响CBS转录。使用28个心血管组织样品的实时RT-PCR结果显示：与CC基因型样本相比， CG样本显示2倍上调表达，而GG样本上调表达近6倍（图1B）。

为了进一步研究增加的CBS mRNA水平是否由-4673Cgt; G变体引起，我们进行萤光素酶测定。如预期的那样，含有保护性G等位基因的质粒显示出比野生型C等位基因显著更高的荧光素酶表达，人胚胎肾293细胞增加52％，大鼠心肌细胞增加42％（图1C） 。这些一致的体内和体外结果证实启动子-4673Cgt; G变体功能性地增加了CBS的转录

变体-4673Cgt; G减弱转录阻遏物SP1结合亲和力

CBS变体-4673Cgt; G与另一个附近变体rs1788484（-4638Ggt; A）完全连锁。进行表面等离子体共振（SPR）分析以测试两种变体的DNA-蛋白质结合能力。在使用HEK293核提取的直接SPR测定中，主要等位基因C的SPR结合活性比次要G等位基因高出1 000倍以上（图2A）。然而，连接的变体-4638G等位基因和A等位基因之间没有结合活性差异（补充信息，图S1）。我们通过添加5-或10倍过量的非生物素化的C / G探针作为竞争者来进行-4673Cgt; G的竞争性SPR测定。在两种竞争测定中的SPR反应证实了直接测定结果，即-4673C等位基因的探针与-4673G等位基因探针相比，对某些转录因子具有显著更高的亲和力（图2B）。

计算机分析（使用阿里巴巴2软件）预测启动子变体-4673Cgt; G可能影响转录因子SP1和GR的结合能力（补充信息，图S2）。然而，染色质免疫沉淀（ChIP）测序结果在在线数据库和其他研究表明CBS启动子可以与转录因子SP1结合，但不能与GR结合。使用HEK293细胞或心脏组织样品的ChIP分析证明CBS启动子的位点-4673被SP1占据（图2C）。具有位点-4673的CBS启动子片段可以用SP1抗体特异沉淀，但不与抗CEBPalpha;或非特异性兔IgG的抗体一起沉淀，这通过PCR扩增证实。共转染实验显示过度表达的SP1通常降低CBS转录，变体-4673C / G扩答启动子的功能差异（图2D）。总之，SP1充当转录阻遏物，-4673Cgt; G变体减弱了与SP1的结合亲和力，最终导致CBS的表达升高。

变体-4673Cgt; G与不同的等位基因启动子的甲基化相关

CBS启动子富含GC，并且变体-4673Cgt; G位于具有高CpG含量的区域内。为了确定CBS表达是否受甲基化状态调控，我们使用5-氮杂-20-脱氧胞苷（5-Aza）抑制HEK293细胞中的DNA甲基化。处理后，与对照组（DMSO处理）相比，CBS mRNA显着增加，表明CBS转录受甲基化状态影响（图3A）。为了探索CBS表达如何受到启动子甲基化状态的影响，我们使用28个心脏组织样品分析了位点-4673周围20个潜在的甲基化位点（图3B）。 CBS mRNA通常在启动子低甲基化水平时上调，其不依赖于-4673Cgt; G SNP。考虑到变异体-4673Cgt; G的等位基因甲基化，近70％的C等位基因至少有一个CpG位点发生甲基化，而几乎80％的G等位基因在任何CpG位点均未被甲基化（图3D）。此外，与C等位基因启动子相比，-4673G等位基因的CBS启动子总是与显著降低的甲基化水平相关（图3C; 15.49％比2.73％，P = 0.0001）。

因此，CBS位点-4673处次要G等位基因的低甲基化连同转录阻遏物SP1结合亲和力的下降将最终促成CBS表达升高。

CBS -4673Cgt; G与成人血浆同型半胱氨酸水平无关

CBS在维持血浆同型半胱氨酸水平方面发挥重要作用，并且CBS缺陷患者显示严重的高同型半胱氨酸血症和高胱氨酸尿症。 我们利用ELA检测了522名健康，禁食本科学生志愿者中CBS -4673Cgt; G变异与血浆同型半胱氨酸水平之间的关系。 结果显示-4673Cgt; G变体与血浆同型半胱氨酸水平无关（图4）。 虽然GG基因型携带者血浆同型半胱氨酸水平低于CC和CG基因型携带者，但差异无统计学意义。

讨论

在这项研究中，CBS基因中的功能性的启动子变异体-4673Cgt; G被确定为在汉族人群的大规模病例对照研究中显著保护个体免受CHD的影响。在同一病例对照组中，我们还发现MTRR8和MTR（未发表）中的非编码变异与CHD风险增加显著相关。 CBS和MTRR / MTR是同源半胱氨酸清除的唯一基因，是在叶酸/同型半胱氨酸代谢途径中系统研究9个基因（CBS，MTRR8，MTR，TYMS19，MTHFR，MTHFD，DNMT1，DNMT3A和DNMT3B）后发现与CHD

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