铅（Pb）诱导的小麦根系生化和超微结构变化外文翻译资料

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铅（Pb）诱导的小麦根系生化和超微结构变化

摘要

本研究的重点是探讨铅（Pb）诱导小麦根系的代谢改变和超微结构变化，以在结构水平上建立铅毒性综合征。铅（50-500mu;M）增强了小麦根系中丙二醛（脂质过氧化的指标）、过氧化氢的含量和电解质渗漏，从而表明活性氧诱导小麦根部的膜完整性和氧化应激的破坏。在铅胁迫后，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强，而抗坏血酸和愈创木酚过氧化物酶的活性下降。通过透射电子显微镜分析，Pb诱导的代谢紊乱使小麦根系的超微结构发生了显著的变化。铅浓度在50mu;M时细胞壁变薄，形成变形虫状突起、褶皱和细胞间隙，而在铅浓度ge;250mu;M时会出现病变和缺口或断裂，并且沿细胞壁沉积，为黑色沉淀物。在铅浓度le;250mu;M时，线粒体的数量显著增加。而铅浓度在ge;250mu;M时，观察到线粒体结构损伤，即形状变化和崩解。在250mu;M时铅降低了核小体的大小并诱导粉团的形成，在500mu;M时导致核小体完全解体或消失。该研究得出结论，铅抑制小麦根系生长，涉及ROS介导的氧化损伤，即细胞膜的超微结构改变以及线粒体和核完整性的破坏。

简介

铅（Pb）是环境中最丰富的重金属污染物，通过人类活动释放出来（Sengar等人，2008）。如汽车尾气、工厂的烟囱、汽油和油漆中的添加剂、化肥和杀虫剂、金属电镀和精加工、矿石冶炼、蓄电池工业的废水和军事行动等各种来源都大大增加了环境中的铅浓度（Kaur等人，2011）。铅释放后，很容易被吸收并在土壤中积累，扰乱土壤生物学（Sengar等人，2008）。作为植物生长发育的非必需元素，铅抑制了种子萌发和幼苗生长，降解色素，甚至导致死亡（Sharma和Dubey 2005）。铅暴露会诱发促氧化作用，并破坏植物的各种生物化学和生理过程(Singh等人, 2011; Kaur等人, 2011)。这些变化包括膜的渗透性、水分状况和激素状态的变化，酶活性的抑制，矿物质营养的紊乱，光合作用、蒸腾作用和DNA合成的减少，以及增强活性氧(ROS)的生成(Sengar等人, 2008)。铅毒性对植物的主要影响包括阻碍根的生长，这主要是由于抑制了根分生组织中的细胞分裂（Eun 等 2000）。其次，它诱发了ROS介导的氧化应激，导致细胞损伤（Liu等人，2009；Małecka等人，2009；Kaur等人，2011）。

早期的研究报告指出，铅会导致ROS的产生，并改变葱（Liu等人，2009年）、芥菜（Meyers等人，2008年）、甜菜（Reddy等人，2005年）、Elodea canadum（Meyers等人，2005年）的氧化代谢（酶促和非酶促）。2005），Elodea canadensis（Dogan等人，2009），香艾叶（Islam等人，2008），羽扇豆（Rucińska等人，1999），豌豆（Małecka等人，2009），小麦（Kaur等人，2011）和玉米（Gupta等人，2009）。此外，一些研究表明，铅改变了沙棘（Heumann 1987）、E. canadensis（Sergio等人，2007）的叶子、Funaria hygrometrica（Krzeslowska等人，2009）的节间段的超微结构，以及E.argyi（Islam等人，2007）和P.sativum（Małecka等人，2009）。然而，这些研究都没有试图将铅引起的超微结构变化与铅诱导的氧化代谢破坏联系起来。因此，我们研究了铅诱导的小麦（T. aestivum）根尖部分的毒性，通过ROS介导的氧化损伤与细胞壁、线粒体和细胞核的相关超微结构变化来揭示铅中毒综合征。

材料和方法

材料

小麦（T. aestivum L. var. PBW 502）种子从当地的种子商店购买。这些种子用次氯酸钠（0.1%, w/v）进行表面消毒，然后在自来水中清洗，再用蒸馏水清洗。铅是以硝酸铅的形式提供的（MW 0 331.21; 纯度0 99%;默克有限公司，孟买，印度）。所有其他用于生化评估和酶学检测的化学品和试剂都是分析试剂级的，采购自印度西斯科研究实验室有限公司;，印度；Loba Chemie，孟买，印度；和美国密苏里州圣路易斯的 Sigma Co.。

铅处理

将20粒小麦种子（在25℃下预吸6小时）放在培养皿（直径15厘米）中，放在Whatman 1号滤纸上，用8.0 ml的50或100或250或500mu;M的铅溶液或蒸馏水（作为对照）浸润。总共有五个处理组，包括对照（0、50、100、250和500mu;M Pb），每个处理组有五个重复。所有的处理都被放置在一个环境控制的生长箱中，在20/10(plusmn;2)℃ 和74plusmn;2%相对湿度下240mu;mol m^-2 s^-1 PFD的14小时(0730-2130) 光周期。

96小时后，测量生长中的幼苗的根和芽长度，用原子吸收分光光度计分别测定根和芽组织中的铅含量。由于铅诱导的抑制作用在根部更为明显，因此这些根部被切除，用10mM CaCl₂清洗，并储存在-40℃进行超微结构研究和氧化损伤评估。

铅的定量

植物材料在70℃烘箱干燥48小时，然后用HNO₃/HClO₄（3:1，v/v）溶液消化。将消化后的样品溶解于去离子水（20 ml）中，4℃保存，待分析。使用EC 4139原子吸收光谱仪对消化液的等分试样（2.0 ml）进行铅分析。对照已知的标准进行测量，并以峰面积为基础。

氧化性损伤的评估

铅诱导的氧化损伤是通过脂质过氧化、过氧化氢（H₂O₂）积累和相对电解质渗漏（REL）来评估的。

脂质过氧化作用

根据Heath和Packer（1968）的规定，脂质过氧化是以丙二醛（MDA）的含量来评估的。为此，将根（100 mg）在预冷的研杵和研钵中用5.0 ml 0.1%三氯乙酸(TCA) 中均质化，并在4℃下以10,000g离心20min。将1 ml上清液与4.0 ml 0.5%的硫代巴比妥酸在20% TCA中混合。将反应混合物在95℃下加热30分钟，冰上冷却后，并在10,000g下离心10min。在532 nm处测量上清液的吸光度，并在600 nm处对非特异性吸光度进行校正。使用消光系数（ε）155 mM^-1 cm^-1计算MDA含量，并以每克鲜重的纳摩尔数表示。

H₂O₂含量

简单地说，在冰浴中用5.0ml的0.1% TCA提取根部。均质液在12,000g下离心15min。在0.5ml的上清液中，加入0.5ml的磷酸盐（PO4^3-）缓冲液（pH7.0）和1.0ml的1M碘化钾。在390nm处读取混合物的吸光度，用ε=0.28mu;M^-1 cm^-1测定H₂O₂含量，并以每克鲜重纳摩尔表示（Singh等人，2008）。

相对电解质泄漏

铅对膜完整性的影响是以根组织的REL来确定的（Singh等人，2007）。根部(200mg）在25℃的蒸馏水（5.0ml）中在试管中培养2小时，并测量沐浴介质的初始电导率（E1）。将装有根的试管煮沸30min来释放所有的电解质，并冷却至25℃，再次测量电导率（E2）。REL的计算方法为：REL =(E1/E2) times; 100。

酶的提取

在冰冷的条件下，将根（250mg）在10.0ml冰冷的100mM PO₄^3-缓冲液（pH7.0）中均质化。匀浆通过三层粗棉布过滤，在4℃下以15,000g离心30min。使用牛血清白蛋白作为校准标准（Lowry等人，1951年），取上清液的等分试样（0.5ml）用于蛋白质评估。将上清液保存在4℃，直到用于测定超氧化物歧化酶（SOD；EC 1.15.1.1）、过氧化氢酶（CAT；EC 1.11.1.6）、抗坏血酸过氧化物酶（APX；EC 1.11.1.11）、愈创木酚过氧化物酶（GPX；EC 1.11.1.7）和谷胱甘肽还原酶（GR；EC 1.6.4.2）的活性。

抗氧化剂酶的测定

SOD的活性是根据其抑制硝基蓝四氮唑（NBT）光化学还原的能力来测定的（Beauchamp and Fridovich 1971）。反应混合物（3.0ml）包括63mu;M NBT、13mM L-蛋氨酸、0.1mM EDTA、13mu;M核黄素、0.05M碳酸钠和0.5ml酶提取物（或0.5ml蒸馏水作为对照）。反应管在两个15W的荧光灯下放置15min，在黑暗中培养15min，在560nm处记录吸光度。一个单位的SOD代表在25°C时抑制NBT的光还原50%的量。

APX活性是通过测量由于抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸而导致的290nm处吸光度的下降（ε=2.8 mM^-1 cm^-1）来确定的（Nakano和Asada 1981）。反应混合物（2.0ml）含有25mM PO₄^3-缓冲液（pH 7.0），0.1mM EDTA，0.25mM抗坏血酸，1.0mM H₂O₂，和0.2ml 酶提取物。

根据Cakmak和Marschner（1992），CAT的活性是以H₂O₂在240nm（ε=39.4 mM^-1 cm^-1）的消失率来测量的。反应混合物（2.0ml）含有25 mM PO₄^3-缓冲液（pH 7.0），10 mM H₂O₂和0.2ml酶提取物。

GPX的活性是通过测量由于愈创木酚氧化引起的470nm处吸光度的增加（ε =26.6 mM^-1 cm^-1）来确定的（Egley等人，1983）。反应混合物（2.0ml）包括25 mM PO₄^3-缓冲液（pH7.0），0.05%愈创木酚，1.0mM H₂O₂，0.1mM EDTA，和0.2ml的酶提取物。

根据Foyer和Halliwell（1976）的规定，GR的活性是以340nm（ε=6.224 mM^-1 cm^-1）的NADPH的氧化来确定的。反应混合物（2.0ml）包括25mM PO₄^3-缓冲液（pH7.0），0.1mM EDTA，0.5 mM GSSG（谷胱甘肽氧化），0.12 mM NADPH，和0.2 ml酶提取物。

APX、GPX、CAT和GR的活性以每毫克蛋白质的酶单位（EU）表示，其中1EU是指在25℃下每分钟分解1.0mu;M底物（抗坏血酸，或愈创木酚，或H₂O₂，或NADPH）的酶量（Singh等人，2007）。

透射电子显微镜检查

将根的顶端部分（分裂区；距顶端约2mm）固定在含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液中，在4℃的条件下，100mM PO₄^3-缓冲液中缓冲12小时。固定的根部用100mM PO₄^3-缓冲液（pH7.2）冲洗三次（每次1小时，4℃）。样品在四氧化锇（OsO₄；1%，w/v，在100mM PO₄^3-缓冲液中；pH=7.2）中4℃后固定2小时，然后用100mM PO₄^3-缓冲液（pH=7.2）冲洗以去除未利用的OsO₄。固定的样品通过一系列的乙醇（30%、50%、70%和80%，v/v，每次30min）交换脱水，嵌入CY212 Araldite树脂（TAAB，英国），并在65℃下热固化48小时后聚合。聚合块用Ultracut UCT超薄切片机（Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany）以60-90 nm的厚度切片。将切片固定在300目方形铜格上，用2%酒精醋酸铀和碱性柠檬酸铅各染色10min，然后用蒸馏水清洗以增强对比度。在FEI Mor-gagnitrade; 268(D)透射电子显微镜（FEI，荷兰）下，在70kV的电压下对染色网格中细胞的超微结构进行超声检查。用MegaView III CCD(Charge-Coupled De- vice)相机(FEI, Holland)在放大率times;8,900-14,000的情况下，以数字方式获取照片。制备和观察每种处理的五个独立重复的切片，包括对照细胞。

统计学分析

实验采用完全随机设计，重复五次；每个重复包括一个含有20颗种子的培养皿。对于生化分析，有五个重复（独立）的组织样

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