源于单纯疱疹病毒1型H129毒株的顺行跨神经元单突触示踪工具外文翻译资料

 2022-05-02 10:05

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源于单纯疱疹病毒1型H129毒株的顺行跨神经元单突触示踪工具

摘要：

背景：单纯疱疹病毒1型H129毒株是一类具有前景的神经环路示踪工具，对现有的逆向标记工具是一个补充。然而，现有的由H129毒株改造而来的示踪工具可以跨多级突触，既不能高亮度地标记出神经元的精细结构也不能标记出只跨单突触的直接投射。

方法：基于H129的细菌人工染色体，我们构建了一系列可用于神经环路示踪的重组病毒。其中包括，通过将两个并联的GFP（green fluorescent protein，绿色荧光蛋白）基因元件插入H129基因组得到的H129-G4和通过敲除胸苷激酶（thymidine kinase, TK）基因并插入tdTomato基因得到的H129-Delta;TK-tdT。随后，我们对这些病毒示踪工具的标记能力进行了体内和体外测试。

结果：H129-G4可以跨多级突触，通过绿色荧光蛋白的表达展现被标记的神经元的精细形态。H129-Delta;TK-tdT在神经元中既不能复制也不能传播，但如果同能表达TK的

辅助病毒共同感染，则可以顺向跨单级突触，通过表达tdTomato标记突触后神经元。H129-Delta;TK-tdT也可以在Cre转基因小鼠的品系中标记特定脑区中特定类型神经元的直接投射组（projectome）。在某些脑区的经典环路中，H129-Delta;TK-tdT的标记模式与前人的结论相符。

结论：在能表达TK的辅助病毒的帮助下，H129-Delta;TK-tdT在最初感染的神经元中进行复制，顺向跨单级突触，用tdTomato标记突触后神经元。H129-Delta;TK-tdT顺向单级示踪系统为标记神经环路连接中的直接投射提供了有效的工具。H129-G4则是顺向多级的示踪工具，可以高亮度地标记神经元的精细形态。

关键词：单纯疱疹病毒1型，H129毒株，顺行，神经示踪，H129，Delta;TK，tdTomato，单突触，H129-G4，多突触

背景：

标记大脑连接体对于理解大脑如何工作十分重要，而标记病理状态下的大脑连接体则对于理解神经退行性疾病（如阿尔茨海默症，帕金森综合症等）的致病机制有重要的意义。作为神经系统行使功能的基本单位，神经环路是连接宏观世界（结构/功能）和微观世界（分子/信号通路）的桥梁。病毒示踪工具促进了新的环路的发现和经典环路新特性的发现。

有效的环路示踪需要顺行、逆行、跨多突触、跨单突触的示踪工具。由狂犬病毒（rabies virus, RV）和伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）改造而来的病毒工具是逆行跨单突触和逆行跨多突触标记输入神经通路的代表工具。单纯疱疹病毒1型H129毒株则是非常具有前景的顺行跨多突触神经环路示踪工具。

HSV-1是一种常见的机会致病菌，初次感染后在神经节中潜伏，对免疫系统正常的个体基本没有伤害，但是经常能使免疫能力低下人群患上唇疱疹和散发性脑炎。其天然的嗜神经和跨神经元传播特性让它成为非常具有前景的神经环路示踪工具。HSV-1型很容易跨神经元传播，其中McIntyre-B毒株逆行传播，而H129毒株顺行传播。大量研究利用H129毒株在不同的动物模型中标记了跨多突触的投射环路和输出网络。值得注意的是，经遗传改造从而能表达荧光蛋白的重组病毒能直接将输出环路可视化，极大地促进了H129毒株的应用。除了H129毒株外，水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）也被报道用于顺行的环路示踪。这些顺行跨多突触的示踪工具在标记输出环路的研究中具有广泛的应用，开发能标记直接投射的顺行跨单突触示踪工具更是有十分重要的意义。

在本研究中，我们引入了一种顺向跨单突触的示踪工具H129-Delta;TK-tdT和一种高亮标记的顺向跨多突触的示踪工具H129-G4。利用辅助病毒表达的TK，H129-Delta;TK-tdT可以跨到下一级神经元并可视化某一脑区核团或某种特定类型神经元的直接投射。H129-G4可以标记跨多突触的投射环路，并高亮标记相应环路的精细结构。这些顺行的示踪工具为投射组的的标记提供了新的工具，丰富了现有的神经环路示踪工具库。

结果：

顺行跨单突触示踪剂H129-Delta;TK-tdT

H129-Delta;TK-tdT通过敲除TK基因而得到（图3a）。TK缺失仅引起了H129在猴肾细胞中很少的生长延迟，但是破坏了H129在体外培养胎鼠神经元中的病毒复制能力（补充材料7：图S7），这一点与文献报道一致。利用辅助病毒如AAV-TK-GFP、AAV-DIO-TK-GFP表达的TK（图3a），H129-Delta;TK-tdT能够跨单级突触传播到下一级突触后神经元。

我们在视觉和嗅觉的通路中对这种跨单突触标记系统的传播方向进行了活体测试。AAV-TK-GFP和H129-Delta;TK-tdT被注射到LGN或MOB，如示意图中所示（图3b和c）。被tdTomato标记到的神经元存在于注射位点（LGN和MOB）（图3b1和c1），以及下游的脑区，包括V1（从LGN传递来），Pir和Aco（从MOB传递来），证明了H129-Delta;TK-tdT的顺向传播特性。在相应的上游脑区（视网膜和MOE）没有发现任何被tdTomato标记到的神经元，表明在该实验条件下H129-Delta;TK-tdT不存在逆向标记，包括轴突吸收和逆行传播。与H129-G4不同，H129-Delta;TK-tdT并没有通过轴突吸收标记到上游的脑区（视网膜和MOE），这可能是合适的病毒滴度和病毒复制缺陷导致（材料和方法，表1和2）。当H129-Delta;TK-tdT被单独注射到这两个脑区，除了注射位点外，未发现任何tdTomato阳性的细胞（补充材料8：图S8f和b）。

这些结果表明，H129-Delta;TK-tdT是一类顺行跨单突触的示踪工具，可以标记到突触后神经元。但是，为了防止轴突吸收造成的错误示踪结果，选取合适的实验条件非常重要。

运用H129-Delta;TK-tdT跨单突触标记VPM的输出

随后，我们在经典通路VPM和S1上对H129-Delta;TK-tdT跨单突触系统进行了活体验证。VPM中的神经元可以投射到S1并在其Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ层中形成突触连接；Ⅵ层中的投射神经元可以投射回VPM和nRT。这种交互连接形式也存在于丘脑nRT中的中继神经元和GABA能神经元之间（图4b）。

AAV-TK-GFP和H129-Delta;TK-tdT按时间顺序先后被注射到野生型C57BL/6小鼠的VPM脑区（图4a）。同单独注射AAV-TK-GFP一样，单独注射H129-Delta;TK-tdT仅微弱标记到了注射位点附近的神经元而没有标记到与之有连接的区域，表明在该实验条件下没有轴突吸收和非特异性传播（图4c和d）。当两种病毒按时间先后顺序（第1天和第22天）注入到VPM相同区域时，第25天在注射位点可发现被GFP和tdTomato共标的神经元（图4e）。这些被双重标记的神经元即为起始细胞（starter cells），在这些起始细胞种，AAV-TK-GFP表达的TK使H129-Delta;TK-tdT能够进行复制。三只小鼠中每只小鼠平均有163.0plusmn;21.83个起始细胞（补充材料9：图S9a）。这些复制的病毒粒子顺向标记突触后神经元并表达tdTomato。然而由于TK缺失导致复制能力缺陷，H129-Delta;TK-tdT只能存在于突触后神经元中。病毒的复制缺陷可能导致tdTomato的低表达，所以需要荧光抗体染色来放大荧光蛋白的信号。

一些表达tdTomato的nRT的神经元在第25天就已出现（图4e2）。第32天，与VPM有连接的相关脑区，包括S1的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ层也可以观测到tdTomato的信号（图4f-h）。我们对这些被标记到的神经元进行了定量分析（补充材料9：图S9a）。来源于VPM的轴突纤维可以被AAV表达的GFP标记（图4f2和f3）。值得注意的是，在nRT被H129-Delta;TK-tdT标记的神经元比在S1中被标记的神经元更早出现，可能是因为VPM到这两个脑区的投射距离不同。

讨论：

某些神经退行性疾病中大脑连接组的损伤情况尚未阐明。揭示健康个体和阿尔茨海默症或帕金森综合症患者神经环路的区别有助于理解这些疾病的致病机制。标记大脑连接组需要合适的示踪工具，而顺行的标记工具有待进一步的研发，尤其是当前还缺少跨单突触的顺行示踪工具。

TK通过催化胸苷和ATP来合成一磷酸腺苷（thymidine monophosphate，TMP），这一过程是三磷酸腺苷（thymidine triphosphate, TTP）合成的重要步骤。绝大多数可增殖细胞，例如猴肾细胞（Vero cells），可以表达TK，从而弥补病毒的TK缺陷让病毒能够复制。然而，像神经元这类非增殖细胞，只含少量TK或者不含TK，导致TTP的合成不足，从而抑制了病毒基因组的复制。因此，H129-Delta;TK-tdT并不能单独在活体神经元内扩散。当与能表达TK的AAV辅助病毒同时侵染细胞时，AAV病毒表达的TK为H129-Delta;TK-tdT的基因组复制提供了条件，从而使病毒能够合成蛋白质并进行病毒粒子的包装。随后，新复制的病毒粒子通过轴突转运，跨过突触，同野生型H129病毒粒子一样传播到突触后神经元，表达tdTomato来标记该细胞。综上所述，H129-Delta;TK-tdT的跨单突触能力来自于TK的顺式删除（in cis deletion）和反式互补（in trans complementation）。

由于已经存在丰富的Cre转基因小鼠品系，H129-Delta;TK-tdT顺向单级示踪系统使标记某一特定脑区内某特定类型神经元的直接投射成为可能。当利用H129-Delta;TK-tdT和相应辅助病毒来标记直接投射时，实验条件的优化非常重要。例如，往往需要设立单独注射H129-Delta;TK-tdT而不注射AAV辅助病毒的平行对照组，这样可以排除轴突吸收的可能性；合适的H129-Delta;TK-tdT滴度可以保证最好的示踪效率（一般注射100-300nl，滴度为3-5times;10^8pfu/ml）；在H129-Delta;TK-tdT注射后合适的时间点进行灌流取样可获得理想的示踪效果（一般为3-12天）。

我们也构建了H129-G4，它是一种能用高亮的GFP高效顺行跨多突触的示踪剂。标记亮度的增强可以使投射通路中神经元的精细形态，包括树突、树突棘和轴突纤维被展现出来。标记亮度的增强也使H129-G4的应用范围得到拓展，比如应用于fMOST（Fluorescence micro-optical sectioning tomography，荧光显微光学切片断层成像系统），一种全脑高分辨率、高通量、自动解析大脑连接组的成像系统。

除了主要的顺行传播，H129毒株极其衍生病毒也可以从轴突末端感染，从而发生从轴突末端到胞体的逆行运输，我们在细胞测试和活体测试中发现了这种感染方式。从我们已有的数据来看，高滴度和长时间表达的条件下，可以观察到轴突吸收现象。轴突吸收和病毒滴度、神经元类型和脑区都有关系，说明实验条件的优化十分重要。在本研究中使用的微流控芯片内存在一个缓慢但持续的培养基的流动现象，该液流能够抵消病毒粒子可能的自由扩散。这样可以保证右旋糖苷（Dextran）和病毒粒子都不会泄露到对面的小室。对不同细胞类型有不同的嗜性是H129毒株轴突吸收的另外一个特点，H129-G4在神经节神经元中比在离体神经元中表现出了更强的轴突吸收现象。相关文献报道了HSV可以从神经元中被释放，在我们的研究中，也发现具有感染能力的H129-G4病毒粒子存在于被感染的体外培养神经元的上清液中。所以一些文献中报道的HSV的“逆行传播”可能是因为二次感染而不是因为HSV自身逆行跨神经元传播的特性。所以，运用上述的跨单突触示踪系统来检测H129毒株的传播方向更加精确。

这种跨多突触的H129示踪工具的缺点之一是被感染的动物存活时间相对较短而且不确定，上述缺点也存在于H129-G中。但是，H129-Delta;TK-tdT跨单突触系统可以解决这个问题。TK缺失影响了病毒在神经元中的复制能力，从而通过限制病毒传播大大降低了其对动物的毒性。在5times;10^5 pfu的滴度下，20天之内，无论是单独注射或者后续补充AAV辅助病毒，H129-Delta;TK-tdT都不会引起动物死亡。小鼠很少或基本不表现出不良反应。

H129毒株的可复制性引起的细胞毒性阻碍了对大脑的功能研究。H129-Delta;TK-tdT的复制能力虽被严重削减，但一些低水平表达的病毒蛋白仍然存在于被感染的神经元中，这会对细胞的功能造成一些影响。由AAV辅助病毒表达的TK使H129-Delta;TK-tdT的复制能力恢复到一定的水平，使病毒蛋白表达水平激增，这比单独的H129-Delta;TK-tdT感染造成了更严重的细胞损伤。由TK缺陷病毒引起的细胞毒性比H129-G4低。细胞毒性的存在以及需要抗体染色来放大信号这些缺点阻碍了H129-Delta;TK-tdT应用于功能示踪，例如电生理，光遗传和钙成像等。但是H129-Delta;TK-tdT可以解析潜在的突触后目标脑区，方便细胞种类的识别，这些都可以被单独的功能研究证实。

结论：

我们构建了源于HSV-1 H129毒株的顺行跨多级突触和跨单级突触的示踪工具。H129-G4是一类跨多突触示踪工具，可以高亮标记神经元的精细结构。H129-Delta;TK-tdT是一类新的顺行跨单突触的示踪工具，可以解析直接投射组的连接。这些示踪工具丰富了现有的神经环路示踪工具库。

方法：

大脑病毒注射：

我们在生物安全二级（BSL-2）实验室中运用立体定位系统进行了大脑病毒注射实验。实验采用8周龄小鼠和成年树鼩，实验动物随机选取并按照标准操作程序（Standard Operating Procedure，SOP），小鼠包括野生型、PV-Cre和DAT-Cre的转基因C57BL/6小鼠。DAT-Cre转基因小鼠在多巴胺转运蛋白（dopamine transporter, DAT）特异性启动子的控制下，能在多巴胺能神经元中特异性地表达Cre重组酶；PV-Cre小鼠仅在小白蛋白中间神经元中表达Cre重组酶。我们用立体

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