Biotechnology and Bioprocess Engineering 20: 901-907 (2015)

DOI 10.1007/s12257-015-0136-7

One-step Purification and Immobilization of His-tagged Protein via Ni² -functionalized Fe₃O₄@Polydopamine Magnetic Nanoparticles

Jianbing Yang, Kefeng Ni, Dongzhi Wei, and Yuhong Ren

Received: 26 February 2015 / Revised: 9 April 2015 / Accepted: 27 May 2015

copy; The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering and Springer 2015

Abstract Ni² -functionalized Fe₃O₄@polydopamine magnetic nanoparticles (Ni² -PD-MNPs) were designed and synthesized by in situ coating of magnetic nanoparticles with polydopamine, followed by conjugation of Ni² to the polydopamine film. The Ni² -PD-MNPs were used to purify His-tagged red fluorescent protein (His-RFP) via affinity interaction between Ni² and the His-tag. The results showed that the Ni² -PD-MNPs had extraordinary selectivity for His-RFP purification. In addition, a Histagged transaminase (omega;-transaminase BJ110) was selectively immobilized onto the Ni² -PD-MNPs without purification, and the immobilized enzyme showed improved specific activity, as well as enhanced stability and reusability.

Keywords: His-tagged protein, immobilization, magnetic nanoparticles, polydopamine, purification

Introduction

The purification and immobilization of proteins of interest are important processes in all areas of biotechnology [1-4]. The development of protein fusion tags has provided an efficient way to separate and purify recombinant fusion proteins through affinity chromatography [5-7]. Purification by fusion tag technology has the following advantages: (1) one-step separation and purification; (2) higher protein activity attained; (3) good versatility and usability for different proteins and different expression systems.

A His-tagged fusion protein could be separated and purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) [8]. Typically, the purification method for fusion tagged proteins had been column chromatography, which was widely used for its high specificity and recovery rate [9,10]. However, this method has many shortcomings, such as its complicated and time-consuming operation. Recently, affinity magnetic nanomaterials have attracted great attention, as the use of these magnetic materials simplifies the purification procedure and effectively shortens the time by magnetic separation. Tural et al. [11] immobilized Histagged recombinant benzaldehyde lyase on a magnetically responsive epoxy-chelate magnetic support. Furthermore, magnetic materials have a large specific surface area that allows for efficient adsorption, and can thus improve the adsorption of proteins, as well as the enrichment and separation of a target protein in a very low-concentration sample. On the other hand, in the research of immobilization, affinity magnetic nanomaterials can be used as carriers to achieve one-step purification and immobilization, thus simplifying the process of immobilization [12-14]. The magnetic immobilized enzyme can be rapidly separated from the reaction liquid by magnetic separation, simplifying the process of continuous operation and achieving cost savings. Xu et al. [15] purified His-tagged protein by using the Polymer Brush Modified Magnetic Nanoparticles. Ho et al. [16] immobilized His-tagged protein by using the iminodiacetate-Cu² modified carrier.

Polydopamine, as a nanomaterialrsquo;s modification coating, has many unique adhesion properties, such as waterproof, strong adhesion, high toughness [17]. After studying mussel byssus protein, Lee et al. [18] concluded that the catechol in dopamine has adhesion ability. The catechol group could form a complex by coordination bonding with metal ions. Yan et al. [19] reported the separation and purification of phosphorylated polypeptides by using Ti² chelated polydopamine. We thus tested Ni² -chelated polydopamine for the separation and purification of Histagged proteins, as well as for the selective immobilization of enzymes. The Ni² -PD-MNPs we used in this article were easily acquired and economic relative to the other purification medium such as nitriolotriacetic-acid-modified mesoporous silicas [20]. And the method of magnetic separation was much more convenient compared with column chromatography. In general, the method we developed is easily carried out and economic.

Materials and Methods

2.1. Materials

Methanol for high-performance liquid chromatography (HPLC) was purchased from Honeywell (USA). Dopamine hydrochloride (analytical reagent (AR) grade), Ferric chloride anhydrous (FeCl₃, AR grade) and ethylene glycol (AR grade) were purchased from Aladdin (China). (S)-alpha;Phenylethylamine, sodium pyruvate, pyridoxal phosphate (PLP) and acetophenone (AR grade) were purchased from Adamas (Switzerland). Isopropyl-beta;-D-thiogalactopyranoside and all other chemicals were of analytical grade purchased from Sinopharm (China).

2.2. Strains and plasmids

The red fluorescent protein (RFP) gene (GenBank: AB779766.1) from Discosoma sp. and the omega;-transaminase BJ110 gene (GenBank: BA000040.2) from Bradyrhizobium japonicum USDA 110 were stored in our laboratory. Escherichia coli DH5alpha; for plasmid preservation and amplification and E. coli BL21 (DE3) for gene expression were purchased from Beijing Kang Century Biotechnology Co., Ltd (China). The expression plasmid pET28a was purchased from Novagen Corpo

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摘要 Ni2 功能化Fe3O4@聚多巴胺磁性纳米粒子 (Ni2 -PD-MNPs) 通过原位涂层聚多巴胺磁性纳米粒子进行了设计和合成, 随后将 Ni2 与聚多巴胺薄膜共轭。Ni2 -PD-MNPs被用来净化组氨酸标记的红色荧光蛋白(His-RFP),通过Ni2 和组氨酸标签的亲和相互作用。结果表明,Ni2 -PD-MNPs对组氨酸-RFP纯化具有特殊的选择性。此外,组氨酸标记的转氨酶 (omega;转氨酶BJ110) 选择性地固定在无纯化的Ni2 -PD-MNPs,固定化酶显示特殊活动的改善,以及稳定性和可重用性的增强。

1. 简介

目标蛋白质的纯化和固定化在生物技术的所有领域中是一个重要过程 [1-4]。蛋白质融合标记的发展为通过亲和层析分离纯化重组融合蛋白提供了一种有效的方法 [5-7]。融合标记技术的纯化具有以下优点:(1)一步分离纯化;(2)获得较高的蛋白质活性;(3)对不同的蛋白质和不同的表达系统具有良好的通用性和实用性。

组氨酸标记的融合蛋白可以通过固定化金属离子亲和层析 (IMAC) 分离纯化 [8]。通常,融合标记蛋白的纯化方法为柱层析,因其高特异性和回收率而广泛应用 [910]。但是,该方法具有操作复杂、耗时多等缺点。近年来,亲和磁性纳米材料得到了极大的重视,因为使用这些磁性材料简化了提纯过程,有效地缩短了磁选时间。图拉尔等[11]在磁响应环氧螯合的磁性支持下固定化带组氨酸标签的重组苯甲醛裂解酶。此外,磁性材料有一个大的特定表面积,允许有效的吸附,从而可以提高蛋白质的吸附,以及在一个非常低浓度的样品下浓缩和分离的目标蛋白。另一方面,在固定化的研究中,亲和磁性纳米材料可以作为载体,实现一步纯化和固定化,从而简化了固定过程 [12-14]。磁性固定化酶可通过磁分离与反应液快速分离,简化了连续操作过程,节省了成本。许等 [15] 用聚合物电刷改性磁性纳米颗粒纯化其组氨酸标记蛋白。Ho等[16]使用亚氨基二乙酸-Cu2 修饰过的载体固定了组氨酸标记的蛋白质。

聚多巴胺作为纳米材料的改性涂料, 具有防水、附着力强、韧性高 [17] 等多种独特的粘结性能。研究贻贝足丝蛋白后, 李等人[18]得出结论:邻苯二酚在多巴胺中具有黏附能力。邻苯二酚组可通过与金属离子的协调结合形成复合物。严等[19]报告了用Ti2 螯合聚多巴胺分离纯化磷酸化多肽。因此,我们测试Ni2 螯合聚多巴胺分离和纯化组氨酸标记蛋白,以及酶的选择性固定化。本文所用的Ni2 -PD-MNPs与其他纯化介质(如氨三乙酸修饰的介孔氧化硅 [20]) 比较容易获得和更加经济。与柱层析相比, 磁分离法更方便。一般而言, 我们开发的方法很容易进行, 而且更经济。

2. 材料和方法

2.1. 材料

高效液相色谱 (HPLC) 甲醇是从霍尼韦尔(美国) 购买的。从阿拉丁(中国) 购买了盐酸多巴胺 (分析试剂(AR) 级)、无水氯化铁 (FeCl3、AR级)和乙二醇 (AR级)。(S)-alpha;苯乙胺、丙酮酸钠、吡哆醛磷酸酯和苯乙酮(AR级)是从阿达玛斯(瑞士)购买的。异丙基beta;-D-硫代半乳糖苷和所有其他化学品都是从国药(中国)购买的分析级.

2.2. 菌株和质粒

红荧光蛋白(RFP)基因(基因库: AB779766.1) 来自 Discosoma sp.，omega;转氨酶BJ110基因(基因库: BA000040.2) 来自美国农业部110日本慢生根瘤菌并储存在我们的实验室。从北京康世纪生物科技有限公司(中国)购买了大肠杆菌 DH5alpha;,用于质粒的保存和扩增,以及大肠杆菌BL21 (DE3) 的基因表达。从Novagen公司(德国)购买了pET28a的表达质粒。

2.3. 基因克隆和表达

红色荧光蛋白(RFP)基因(基因库:AB779766.1)在扩增时使用正向引物5 #39;-GGAATTCCATATGGCCTCCTCCGAGAAC-3反向引5 #39;-CGGGATCCTTACAGGAACAGGTGGTG-3, 分别带有 NdeI 和 BamHI 限制站点。omega;转氨酶BJ110基因(基因库: BA000040.2) 被扩增，使用正向引物5 #39;-GGAATTCC ATATGTCCATGCTGCCGAATTCGCAAGAGG-3#39;反向引物5 #39;-CGCGGATCCTTATGCGGCCGCAAGCTTTTA-3#39;,分别带有NdeI和BamHI限制点。消化后NdeI和BamHI限制酶,扩增片段被结合到带有N末端定位组氨酸的标记pET-28a载体框架。重组大肠杆菌BL21 (DE3) 在Luria-Bertani培养基中生长，表达其 RFP 和omega;转氨酶BJ110, 含有50micro;g/ml卡那霉素。当600nm的区域性光学密度达到0.6 ～0.8时, 异丙基beta;-D-巯代被添加至浓度为0.1mM。在25°c诱导16小时后, 细胞以8000g的离心法在4°c 中提取10分钟。收集的细胞被悬浮在磷酸钠缓冲液 (pH值7.4)，在冰上超声99次,每次5秒，时间间隔为4秒。细胞裂解液离心1万g,在4下离心20分钟,并收集上清。

2.4. 通过溶剂热合成法合成了Ni2 -PD-MNPs

磁性纳米粒子的合成和表征[21]。首先,在100毫升的乙二醇中加入3.25克FeCl3和1.00 克柠檬酸钠, 然后添加60.00克醋酸钠。该溶液在室温下搅拌30分钟, 在200°c 12小时前被搅动。黑色固体与磁铁分离,然后用乙醇和水反复冲洗。至此合成了MNPs。MNPs(0.1克)超声波分散在100毫升10毫米三盐酸(pH 8.5)为15分钟。然后, 加入0.1克多巴胺盐酸盐, 在室温下，进行了12小时的反应, 并通过磁分离和去离子水水洗多次得到PD-MNPs。然后将 PD-MNPs 添加到100毫升100mM NiSO4溶液中,在室温下搅拌2小时。 磁分离的溶液呈现Ni2 -PD-MNPs, 得到的Ni2 -PD-MNPs储存在去离子水中。

扫描电镜(SEM)图像是通过 JSM-6360LV(日本JEOL)扫描电子显微镜获得的。x射线衍射(XRD)的材料阶段的识别是用利用日本理学株式会社的2550x射线衍射仪 (日本理学株式会社，日本), 利用铜靶作为衍射源，波长0.154nm。用x射线光电子能谱(XPS)分析了材料表面的元素组成,x射线源为A1 Kalpha;。利用KBr颗粒 (尼科莱特) 在6700傅里叶光谱仪上采集傅里叶变换红外光谱(IR)。在x射线光谱仪中进行了能量色散x射线光谱学 (EDX)。

2.5. His标记的红色的分离和纯化荧光蛋白

一毫升磁性分离的Ni2 -PD-MNPs(10毫克/毫升)被超声波分散为5分钟750micro;L磷酸盐缓冲盐 (PBS) 缓冲 (pH7.4, 20 mM), 随后250micro;L的细胞裂解含有红色荧光蛋白 (RFP;添加了2毫克/毫升的总蛋白浓度)。在室温下孵化5分钟后, 溶液被磁铁磁分离。然后,添加了1毫升含有10mM咪唑的PBS缓冲液,以去除非特异性的束缚蛋白,通过添加1毫升含有300mM咪唑的PBS缓冲液His-RFP被最终洗脱。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) 测定了His-RFP 的纯度,用荧光显微镜观察了Ni2 -PD-MNPs与RFPs的结合。

2.6. 有选择地固定omega;转氨酶 BJ110

300 micro;L 的磁分离镍2 -PD-MNPs(10毫克/毫升),超声波分散在250micro;L的PBS缓冲 (pH 7.4, 20mM),加入250micro;L的细胞裂解酶BJ110 (总蛋白浓度为1毫克/毫升)。在室温孵育30分钟后,混合物被磁性分离。用布拉德福德测定法测定了固定前后溶液中总蛋白的变化[22]。用其催化反应检测固定化omega;转氨酶 BJ110 的活性,其中alpha;-苯乙胺和丙酮酸钠产生苯乙酮和丙氨酸。1毫升反应系统, 包括50mM PBS缓冲溶液(pH 8.0),10mM(S)-alpha;苯乙胺和丙酮酸钠,和0.1 mM辅酶吡哆醛磷酸酯(PLP), 在37°c下振荡10分钟。然后,添加了200micro;L1M HCl以终止反应。在210nm处利用高效液相色谱技术对反应产物进行了分析，采用1100系列色谱仪和SBC18圆柱 (250x4.6毫米,5 micro;m;安捷伦技术公司, 圣克拉拉,加利福尼亚州,美国)。

2.7. 固定化酶的温度、pH 稳定性和可重用性

为了测定酶的温度稳定性, 在介于16和50°c之间的室内温度下,以3小时为标准,对 PBS 缓冲液中的固定化酶 (pH 7.4、20mM) 进行了孵化,并对其残留活性进行了测定。为了测量酶的pH稳定性, 固定化酶在4°c温度下，在 20 mM的PBS缓冲液中培养24小时, pH值从pH5到10不等, 然后测定剩余活性。使用游离酶作为控制。固定化酶的可复用性是由连续多批次反应决定的,通过磁分离在每批的末端回收固定化酶,然后用PBS对下一批进行清洗。该反应共进行了10批次, 其中第一批的活动回收率被视为100%。

3. 结果和讨论

3.1. Ni2 -PD-MNPs 的表征

合成材料的XRD分析揭示了30.1°、37.1°、43.1°、53.4°、57°和62.6°衍射角的衍射峰 (图 1A), 对应于Fe3O4晶体平面衍射220、311、400、422、511和440,分别证明合成的MNPs与Fe3O4晶体平面衍射标准卡(JCPDS 文件 85-1436) 相比, 具有反式尖晶石 Fe3O4结构。用德拜-谢瑞公式计算每个晶体平面的直径[23]，给出Fe3O4粒子在MNPs中约为38.1nm的平均直径。另外, 用 Ni2 对聚多巴胺螯合的改性对晶体形貌没有影响。SEM表明, MNPs均匀, 球形, 分散, 直径约200纳米。经聚多巴胺改性后, PD-MNP形貌不规则,直径约为250 nm, 表明聚多巴胺膜的厚度约为25纳米(图1B)。

用红外光谱(图1C)分析了表面官能团。在MNPs的红外光谱中,峰值在1061/cm对应于CO拉伸振动,即在1362/cm是羧基的OH振动弯曲,并且1560/cm是羧酸的拉伸振动。结果表明,在其表面上用柠檬酸成功地改性了合成的MNP。聚多巴胺包被后,关于PD-MNPs的傅里叶变换红外光谱上的1061和 1362/cm峰消失,说明材料表面上的柠檬酸被隐藏了。出现的1240/cm峰值来自于苯酚的拉伸振动,1565/cm来源于酰胺II波段N-H振动响应,表明聚多巴胺在材料表面存在。因此, 红外光谱识别证明聚多巴胺已成功包被在MNPs上。

MNPs的XPS谱(补充图1) 显示了C1s和O1s的大峰值。MNPs中的O1s是由两个峰值后形成的, 对应于Fe-O峰(529.5 eV)和O=C峰(530.2 eV)(补充图1A)。这进一步说明了MNP表面已与柠檬酸结合。与此相反, 在MNPs的XPS光谱中, Fe2p的整个峰值消失了,表明MNPs表面完全包裹,厚度超过10 nm (因为XPS的深度可探测约7～10 nm)。此外,N1s和O1s峰的出现是因为O=C(531.5 eV),再次证明聚多巴胺已经被成功包被(补充图1B)。将 PD-MNPs与Ni2 混合后,生成的Ni2 -PD-MNPs的XPS光谱中呈现Ni2p峰值, 其中Ni2 的百分比从峰值面积计算为0.62% (补充图1C)。EDX分析还证实了镍在Ni2 -PD-MNPs (图 1D)中的存在,进一步证明了镍离子成功地螯合到材料上。

磁滞回路(补充图2 揭示了MNPs涂层前后室温下的超顺磁性行为(无滞回行为)。MNPs、PD-MNPs和Ni2 -PD-MNPs的饱和磁化率分别为71.54、60.43 和61.16。结果表明,PD和Ni2 的改性对MNPs的磁性能没有显著影响。

3.2. 镍2 -PD-MNPs 对组氨酸标记蛋白的特异性

为了研究Ni2 -PD-MNPs对His-RFP的特异性,合成的材料与含有His-RFP的细胞裂解物混合。磁分离后,原红颜色消失,表明其在溶液中的RFP与Ni2 -PD-MNPs相结合。我们通过荧光显微镜观察了Ni2 -PD-MNPs与His-RFP的结合。通过比较Ni2 -PD-MNPs聚合体的相同场域(图2),我们发现Ni2 -PD-MNPs有红色荧光, 表明His-RFP与材料表面结合。

用含有咪唑淋洗液对Ni2 -PD-MNP-His-RFP结合体进行洗脱后,用SDS-PAGE分析了该蛋白的纯度;结果如图3所示。与Ni2 -PD-MNPs混合后,细胞裂解物中的靶蛋白明显减少,其他蛋白带的变化不显著。咪唑洗脱后,淋洗出单一的蛋白条带.这些现象表明,His-RFP可以专门与Ni2 -PD-MNPs结合,证明Ni2 -PD-MNPs可以有效地用于分离和纯化组氨酸标记的蛋白质。

此外,我们还研究Ni2 -PD-MNPs的可重用性,以分离纯化His-RFP。洗脱材料可用于下一批,用SDS-PAGE检测其纯度(图3)。即使是在重复使用后,Ni2 -PD-MNPs仍持续显示它对His-RFP良好的特异性, 因为洗脱下来的蛋白的纯度很高。然而,材料与His-RFP结合的能力在反复使用后降低,在淋洗过程中蛋白质的浓度逐渐降低,也许是因为Ni2 已经脱离了材料。由于Ni2 -PD-MNPs可以专门与带组氨酸标签的蛋白质结合, 我们利用它选择

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