对斑马鱼肝脏的形变化、乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制作用外文翻译资料

 2022-06-14 09:06

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题目：对斑马鱼肝脏的形变化、乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的抑制作用

翻译：董委，班级：生物技术 1402 班 指导老师：张德禄

摘要：富营养化水体产生的水华束丝藻分泌的麻痹性贝类毒素（PSPs）属于神经毒素。该毒素威胁环境安全和人类健康。尽管麻痹性贝类神经毒素的分子致毒机制已经被广泛研究，但仍有一些问题存在较大争议，需要进行进一步研究，这些问题包括体内肝神经递质的失活，生理解毒以及组织结构和超微结构的改变等。本实验中所使用的神经毒素是从滇池水华束丝藻中提取纯化，经过高效液相色谱法分析表明，其主要成分是膝沟藻毒素1、膝沟藻毒素5和新石房蛤毒素。通过腹腔注射（5.3和7.61mu;g/STXeq/kgbw作为低剂量和高剂量）对斑马鱼进行毒素处理，在染毒后24小时内的不同时间点，检测斑马鱼肝脏的形态学改变、乙酰胆碱酯酶（AChE）和单胺氧化酶（MAO）神经递质传导功能的变化。研究表明，斑马鱼在注射束丝藻毒素后3-12小时期间，其肝脏的丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）活性显着升高，肝脏的组织结构和超微结构出现损伤。毒素的注射增加了斑马鱼肝脏中的活性氧含量和总抗氧化能力，这表明束丝藻毒素能引起斑马鱼肝脏氧化应激。进而造成肝脏的AChE和MAO活性受到显着抑制，这表明斑马鱼肝脏中神经递质的灭活功能出现异常。所有的这些变化都具有剂量和时间依赖效应关系。这些表明，束丝藻毒素是通过抑制肝脏组织的乙酰胆碱酯酶和单胺氧化酶的活性从而诱导肝脏氧化应激，最终导致斑马鱼肝脏的组织结构和超微结构异常的神经毒性。上述这些参数可用作研究检测自然水体中的束丝藻水华及其束丝藻毒素的生物标志物。

关键词：蓝藻毒素；斑马鱼肝脏；形态改变；乙酰胆碱酯酶；单胺氧化酶；神经毒性

1、引言

蓝藻水华会分泌以蓝藻毒素或麻痹性贝类毒素（PSPs）为主的毒素。这种现象发生在世界范围并成为了一个全球性的问题。这种水华和有害的次级代谢产物（蓝藻毒素）对水生态系统有害。滇池水华以滇池一号菌株为主。近几十年来滇池为中国云南省昆明市附近的几百万人提供了农业、饮用、娱乐和旅游的淡水资源。 水华及其相关毒素一直是造成环境安全和人类健康问题的原因。

束丝藻毒素（PSPs）是强有力的生物碱类神经毒素，主要存在于在海洋中由甲藻类产生，但是在淡水中也可由淡水蓝细菌分泌。 PSPs可能在水生动物中高度积累而不会立即产生影响。然而，人类或其他动物食用这些受污染的水生动物会导致中毒。 此外，使用一般的处理方法如蒸煮（因为它们对热、酸和碱有很强的抵抗力）可能不可以完全除去其毒性。

鱼通常被认为是水生食物链顶端的重要生物，因此也是水生生态系统整体健康的代表性指标。斑马鱼是淡水生态系统中重要的模式生物。近年来，由于其适用于监测环境污染物及其对有毒物质的适应能力，人们对斑马鱼的研究越来越多。斑马鱼能合成最典型的脊椎动物神经递质，其神经内分泌系统能表现出对压力的生理应激反应。斑马鱼还具有体积小、成本低、繁殖容易、繁殖周期短、产蛋量高、外部受精和发育、透明胚和遗传背景良好的典型优势。目前的研究表明PSPs可能通过食鱼类用受PSPs污染的食物进入鱼类体内在肌肉中蓄积并影响其发育，导致游泳能力受损，并且可能导致幼鱼和成鱼的畸形或死亡。

肝对毒素的解毒和代谢非常重要。丙氨酸转氨酶（ALT），天冬氨酸转氨酶（AST），活性氧（ROS）和总抗氧化能力（T-AOC）的组织结构或超结构的改变是可用于评估对各种人类或天然污染物的影响效果的有价值的参数。单胺氧化酶（MAO）和乙酰胆碱酯酶（AChE）是涉及单胺类神经递质的分解的关键酶。以前的研究已经研究了阿特拉津，农药和微囊藻毒素对这些动物参数的影响。然而，关于细菌性神经毒素或PSPs对这些肝脏解毒和代谢的标记物影响的信息很少。

本研究主要调查亚致死剂量的滇池一号产生的束丝藻毒素对肝脏组织结构和超微结构、ALT、AST、ROS、T-AOC、AChE和MAO活性在斑马鱼中的神经毒性作用。 这些结果将进一步理解肝脏在鱼类代谢和束丝藻毒素解毒中的作用。

2、材料和方法

2.1、化学药品

所有测量生化参数的试剂盒都购买于南京建成生物工程研究所（中国，南京），PSP毒素的参考标准包括STX毒素组（dcSTX，STX，neoSTX）和膝沟藻毒素组（GTX1-5，dcGTX2，3），购买于加拿大国家研究委员会（哈利法克斯，新斯科舍省，加拿大），其他所有的化学试剂除特别说明外，均为国家标准品。

2.2、毒素制备

从滇池水华中采集滇池一号菌株在无菌BG11培养基中培养，收集其产生的毒素在-20℃冰箱冷冻封存等待进一步分析。使用0.01mol/L醋酸溶液萃取毒素两次，沉淀纯化，过滤并在旋转蒸发仪中浓缩至干，最后用Sep-Pak C18柱进行过滤。使用LC20A高效液相色谱（HPLC）系统进行荧光监测分析毒素。 使用Shimadzu Class-CR10软件（Shimadzu）处理数据，通过将它们的色谱图与参照标准品的色谱图进行比较来确定从滇池一号菌株中提取的STX和GTX。毒素浓度由响应因子（峰面积/毒素浓度）决定。样品总体毒性的计算借助于与STX物质的量等价的毒素和它与STX相对毒性的比较，毒素纯化后保存于-20℃。

2.3、剂量确定

根据以前的研究进行一些修改，共用约300条鱼来确定毒素剂量。使用50uL的一次性无菌微量注射器进行腹腔注射30ul毒素。毒素的起始浓度为50mu;g/ml（5mu;L，含量9.28mu;g/ kg，6.4mu;g STXeq / kg毒素，用0.01mol /L乙酸稀释至30mu;L）。如果该鱼在24小时内死亡，随后的鱼注射较低浓度毒素（用0.01mol /L乙酸稀释），但如果注射的鱼在24小时内存活，则随后的鱼注射更高浓度毒素。这个过程一直持续进行直到找出导致0%和100%死亡率的最大剂量和最小剂量。最后找到两种剂量分别为：5.3和7.61mu;g STXeq/kg，分别表示低剂量和高剂量。低剂量毒素产生明显的行为毒性但不导致死亡，高剂量毒素造成行为毒性而且有30%的死亡率。通过0.01mol /L乙酸可以控制动物的接收效率。

2.4、肝脏样品的制备

本次实验中取同一批受精的150条健康的雄性斑马鱼同时培养。驯化10天后，将150条鱼随机均分成三组（对照组、低剂量组、高剂量组），低剂量组和高剂量组分别通过腹腔注射30uL 用0.01mol/L乙酸稀释的5.3或7.61ug STXeq / kg的束丝藻毒素。对照组单独注射30uL 0.01mol/L乙酸溶液。注毒后1，3，6，9，12和24 h，将每组5只鱼进行冷敷（-8℃下冰颗粒）。肝脏冻结于-40℃以分析生理参数，或固定在10％中性甲醛固定液中用于组织结构分析，或固定在2.5％w / v戊二醛中用于超微结构分析。根据考马斯亮蓝G-250法测定肝脏提取物中的蛋白质浓度。

2.5、肝脏组织切片

将斑马鱼的肝脏用10％中性甲醛溶液固定超过24小时，用自来水冲洗，在一系列梯度乙醇浴中脱水，在二甲苯中清洗，并用石蜡包埋。 将切片（6mu;m）用苏木精 - 伊红染色并在显微镜下观察。

2.6、肝脏超微结构的检查

每个时间点各组鱼的肝脏用2.5％w / v戊二醛预处理2 h以上，在0.1mol /L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中冲洗3次，并在-4℃下在1％w/v四氧化锇中固定2小时。 然后将肝组织嵌入Epon 812中，并使用超薄切片机切割连续的超薄切片。 用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色，用透射电子显微镜观察。

2.7、生化参数的检测

根据制造商的说明，使用商用诊断试剂盒检测ALT、AST、ROS、T-AOC、MAO和AChE。 在96孔酶标板中检查反应产物的吸光度（OD）。 ALT和AST活性单位表示为每毫克蛋白质的酶活性单位(U mg/ protein)。一个单位ROS减少1umol L-1 H2O2 mg proteinminus;1min-1 (U mg proteinminus;1)。 一个单位的T-AOC被定义为在37℃每分钟反应溶液中每毫克蛋白质的吸光度增加0.01 OD值的量(U mg proteinminus;1)。当每1毫克蛋白质每6分钟水解1微摩尔底物时，根据1 U mg proteinminus;1计算AChE活性。MAO活性的一个活性单位被定义为在37℃时吸光度增加0.01的量（U mg protein-1）。

2.8、统计分析

使用统计软件（SPSS 16.0，Chicago，IL，USA）分析数据。 ALT、AST、ROS、T-AOC、AChE和MAO的每个结果是三次独立实验的平均值。组间显著差异采用单因素方差分析，比较值P＜0.05则认为差异显著的，P＜0.01则认为差异较显著，而P＜0.001则认为差异十分显著。

3、结果

3.1、毒素分析

根据对照毒物标准，高效液相色谱分析表明，从培养的滇池一号中提取的束丝藻毒素包括三种有毒成分neoSTX、GTX1和GTX5。滇池一号总PSPs毒素含量为9.52ng/mg干重。 根据GTX1，GTX5和neoSTX与STX的相对毒性比率，样品的总体毒性分别为6.51ngSTXeq / mg干重。 HPLC-FLD分析证实提取的毒素纯度为69.57％。 GTX1为主要毒素，占PSPs总量的34.04％，其次是GTX5和neoSTX，分别占PSP毒性总量的21.28％和12.77％。 然而，PSPs中的C毒素标准（N-磺基氨基甲酰基-11-羟基硫酸盐）不可用，因此它们的毒素谱未被分析。需要进一步的研究以分析存在于相同样品中的其它分子。

3.2、ALT活性的变化

斑马鱼肝脏中ALT活性显着高于正常对照鱼组（p lt;0.05）。 在注毒3-12h后，高剂量组和低剂量组的平均ALT活性分别是对照组的3.15倍和1.67倍。 肝脏中ALT水平在注毒后1h增加，在注毒后3-12h时进一步增加，在12h达到最大值，高剂量组和低剂量组相对于对照组分别平均增加2.49倍和1.81倍。在注毒斑马鱼肝脏中的ALT活性在24小时后逐渐恢复。

3.3、AST活性的变化

与正常对照组相比，注射毒组的斑马鱼肝脏AST活性显着增加（p lt;0.05）。 在注毒后3-12 h，高剂量组和低剂量组的AST活性分别是对照组的1.69倍和1.49倍。 注毒后1h，肝脏AST活性进一步升高，注毒后3-12h进一步升高，12h达到最大值，高、低剂量组与对照组平均分别增加1.78倍和1.55倍。 在注毒斑马鱼肝脏中AST含量在24小时逐后渐恢复。

3.4、肝组织结构变化

注毒斑马鱼的肝脏组织结构发生改变。 两个注毒组在初始阶段（从1到3h）显示出类似的组织结构差异，在1小时后充血过度，然后在注射3h后出现水肿。 高剂量组在6〜12 h内浮肿明显增加，肝细胞空泡化和坏死，低剂量组出现进行性核浓缩和凋亡。 两个注毒组在24小时后部分恢复。

3.5、肝脏超微结构的变化

透射电镜显示注毒组肝脏超微结构和肝细胞异常。注毒组细胞间隙增宽，细胞质和细胞器水肿、空泡化，细胞骨架和细胞器破坏，糖原减少，脂质积聚，核变形并形成凋亡小体。注毒组中的肝细胞在注毒后1h表现出水肿（光透射率增大），随后在注毒后3h，包括线粒体、内质网和核膜的细胞器均出现水肿，其特征在于细胞内空泡。细胞器和细胞水肿在注毒6h后进一步加剧，并且一些空泡变大，由于液泡挤压而导致细胞核变形。然而，高剂量组和低剂量组细胞和细胞器的结构改变不同。高剂量组出现空泡破裂或细胞器结构破坏，透光率增加，细胞凋亡增多，低剂量组9-12h出现类凋亡小体。注毒组在12-24h部分恢复。这些结果表明，低浓度的束丝藻毒素主要引起凋亡，而高浓度引起坏死。

3.6、ROS含量的变化

与正常对照组相比，接受束丝藻毒素注射组的斑马鱼肝脏中的ROS含量显着增加（p lt;0.05）。 注毒后1〜12 h，高、低剂量组平均ROS含量分别高于对照组的3.15倍和2.55倍。 然而，注毒12-24h后ROS含量没有明显差异。 肝脏ROS含量在注毒1h后增加，注毒后3-12h增加更明显。 在高，低剂量组分别与对照组比较，12 h和9 h达到最大ROS活性，平均增加3.78倍和2.89倍。 注毒的动物肝脏中的ROS含量在24小时后逐渐恢复。

3.7、T-AOC活性的变化

与对照组相比，接受束丝藻毒素处理的斑马鱼肝脏中的T-AOC活性显着降低（p lt;0.05）。 在注毒的斑马鱼组中，平均肝脏T-AOC活性在给药后3-12h显着降低，高剂量组和低剂量组分别为对照值的61.38％和49.27％。 注射后1h有明显增加，并在12-24h部分恢复。 平均最低T-AOC活性发生在接触后12h，高、低剂量组分别为69.09％和52.31％。 然而，在高剂量组和低剂量组中，平均T-AOC活性在注毒后1h分别增加1.45倍和1.27倍。 T-AOC活性在注毒后12-24h之间部分恢复。

3.8、AChE活性变化

在注毒斑马鱼和对照

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