聚乙二醇化的人血清白蛋白：聚乙二醇化，纯化和表征方法的综述外文翻译资料

 2021-12-02 10:12

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聚乙二醇化的人血清白蛋白：聚乙二醇化，纯化和表征方法的综述

摘要：人血清白蛋白（HSA）是一种无糖基修饰的带负电荷的蛋白质（相对分子量约65 kDa），它具有一个游离半胱氨酸残基（Cys 34）和17个二硫键，这些二硫键在维持其稳定性和更长的体内半衰期（15至19天）中起主要作用。由于HSA是一种多功能蛋白质，所以除了在各种疾病中维持胶体渗透压（COP）的作用外，它还可以与其他分子和离子结合。在危重疾病中，血管内腔和血管外腔之间白蛋白水平的变化和血清浓度的降低需要使用外源性白蛋白来补偿。由于HSA的大小是其滞留在血液循环中的重要参数，因此可以通过共价连接聚乙二醇（PEG）（称为聚乙二醇化）增加HSA的分子大小和流体动力学半径。HSA作为良好的血液容量扩充剂不仅可以预防间质水肿，还可以降低输液频率。本综述致力于介绍HSA的各种聚乙二醇化方法（固相和液相），并对各种纯化和表征聚乙二醇化的HSA的方法进行了比较。

引言

人血清白蛋白（HSA）是一种带负电的非糖基化血浆蛋白，分子量约为65 kDa。它是由585个氨基酸组成的具有四级螺旋结构的单链多肽。HSA有一个“心形”的空间结构，许多配体的结合位点位于分子的中心，由疏水基团组成，而其外部由亲水配体组成。

HSA的负电荷是由于酸性氨基酸残基数量超过碱性氨基酸残基的数量，这导致在pH 7.0（pI 4.7）下每分子带有约15个负电荷。在HSA的结构中，存在一个游离半胱氨酸残基（Cys 34）和17个二硫键，这些二硫键明显有助于该蛋白质的稳定，并解释了其较长的生物学寿命。肝细胞每天产生大约9-12克的白蛋白，但是细胞内并没有贮存蛋白的贮存库，是由胶质渗透压和血管外肝空间的渗透压的变化控制白蛋白的生产速率。白蛋白是丰度最高的人血浆蛋白，生理浓度40-50 g/L（3.5-5 g /dL），占血浆总蛋白含量的50％，占血浆渗透压的50％（25 mmHg）。全身白蛋白含量为4至5 g/kg，其中三分之一在血管内空间中，三分之二在血管外腔中。白蛋白在血浆和间质之间以恒定的过程进行交换，其半衰期平均为15至19天。这种蛋白用于治疗多种疾病，包括血容量不足，休克，烧伤，手术失血，创伤，出血，心肺旁路，急性呼吸窘迫综合征，血液透析，急性肝功能衰竭，慢性肝病，营养支持，复苏和低蛋白血症，其具有广泛的临床应用。最近，已发现白蛋白与低白蛋白血症、肺水肿甚至心力衰竭有关，表明其可以作为一种有效的预兆生物标志物。HSA是一种多功能蛋白质，除了维持胶体渗透压（COP）外，还有着其他功能如结合其他分子和离子的能力。这些包括通过结合氢离子的缓冲能力；运输激素；中和毒素如胆红素，以及促进血浆的氧化还原电位、结合和运输药物。白蛋白是一种自由基清除剂，是减少巯基(参与一氧化氮代谢的硫醇)的主要来源。它还具有维持膜通透性的作用。

可以通过商业途径获取5％和20％白蛋白溶液。 5％HSA能形成与正常血浆相同的渗透压。它们的生产方法是人血浆通过加入乙醇进行分离（Cohn分级方案）及热处理数小时。该方法的产率至少为95％。用离子交换和/或凝胶过滤色谱方法，可以以进一步降低回收率为代价，将纯度提高到99％。

如上所述，HSA是一种单体多结构域大分子，是血浆渗透压的主要决定因素，也是体腔间液体分布的主要调节剂。另一方面，我们知道危重的疾病会改变血管内和血管外腔白蛋白的分布。血清浓度降低，直到疾病的恢复阶段才会得到补充。因此，在这种情况下使用外源白蛋白来增加其血清浓度是有益的。但是白蛋白在危重疾病中的分布变化是由于毛细血管渗漏的增加而导致的，而蛋白质的大小一直被认为是维持其在血液循环的一个重要因素，因此增加HSA分子大小和流体动力学半径可能是获得优质容量扩充剂的潜在方法。这样不仅可以预防间质水肿，还可以降低注射频率。聚乙二醇与蛋白质的共价连接，称为聚乙二醇化。它除具有增加蛋白质热稳定性和物理稳定性，防止酶降解，降低蛋白质的免疫原性，抗原性和毒性等广泛优势以外，也可增加蛋白质的表观大小，从而通过减少肾脏过滤和改变生物分布来延长其半衰期。各种因素可影响聚乙二醇化反应和聚乙二醇化蛋白质的特性，这些因素包括：分子量，结构和与蛋白质连接的聚乙二醇链的数量；蛋白质上的聚乙二醇化位点；聚乙二醇化化学过程；pH，温度和反应时间；蛋白质与聚乙二醇的摩尔比；甚至纯化方法等等。该综述将聚焦各种聚乙二醇化HSA的方法，并且还将比较不同的聚乙二醇化HSA的纯化和表征方法。

聚乙二醇化HSA

液相聚乙二醇化

这种类型的聚乙二醇化是常用的方法，可以在罐中进行间歇反应。在这种方法中，蛋白质与聚乙二醇试剂在搅拌的槽反应器中反应，同时存在其他试剂(如果需要的话)。

定点聚乙二醇化

在半胱氨酸34（Cys34）的聚乙二醇化: Ting Zhao等用20 kDa的聚乙二醇-马来酰亚胺（PEG-Mal）特异性的在Cys34将HSA聚乙二醇化。他们进行这个反应启发自HSA游离Cys34巯基和20 kDa的PEG-Mal高特异性的反应活性。他们检测了不同蛋白/聚合物摩尔比和不同pH值的反应缓冲液，分别为50 mmol/L磷酸盐、10 mmol/L乙烯二胺四乙酸(EDTA)。他们还将反应混合物在37 ℃下孵育了不同的时间。为了使反应结束，待孵育期结束后，他们用反应缓冲液将反应混合物稀释至10倍。

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对最终反应混合物的改性率和同质性进行了研究，结果表明，单聚乙二醇化HSA具有良好的化学性质和分子同质性。

用SDS-PAGE对聚乙二醇化蛋白的纯度进行表征后，分别用巯基堵塞法和圆二色性(CD)分析了聚乙二醇化位点和二级结构。研究了改性蛋白在LPS致小鼠肺损伤、LPS致全身毛细血管渗漏的败血症模型和正常小鼠体内的药代动力学。他们推断，在相关疾病增加毛细管通透性方面，化学上定义明确、分子同质的聚乙二醇化的HSA优于天然的HSA，原因如下:

-聚乙二醇-HSA较高的生物半衰期(2.3倍)

-降低聚乙二醇-HSA的血管通透性

-使用聚乙二醇-HSA治疗的大鼠，其血压和血液稀释率较天然的HSA更有可能恢复。而且，即使是这种单一的HSA也可能有助于防止产生二聚体。

N -端聚乙二醇化

N-端聚乙二醇化的位点特异性是其利用了N-端氨基酸残基的alpha;-氨基的pKa值与蛋白质主链中Lys残基的ε-氨基之间的差异。HSA具有58个赖氨酸残基，其ε-氨基具有明显高的pKa值，约10.8，其比N-端alpha;-氨基（pKa值为8.0）碱性更强。如Kinstler等报道的mPEG丙醛或其他醛，在酸性条件下（约pH 5）对N-端的alpha;-氨基具有很大的选择性，因为与其他的亲核试剂相比它具有较低的pKa。

为了获得N-端单聚乙二醇化的HSA，如图1所示，mPEG-丙醛应通过席夫碱反应与蛋白质的N-端氨基酸残基的游离alpha;-氨基偶联，再使用硼氢化钠这种温和的还原剂还原产生稳定的仲胺键。

在2012年，Ting Zhao等人通过N-端氨基酸残基的游离alpha;-氨基将HSA与20kDa mPEG-丙醛结合，得到单聚乙二醇化HSA。孵育时间过后，用10mM pH 6.5的磷酸盐将混合物稀10倍来停止反应。它们使用的反应条件总结在表1中。

使用线性梯度的离子交换色谱在DEAE琼脂糖凝胶FF柱上分离单聚乙二醇化的HSA。再通过超滤（30 kDa截留膜）使单聚乙二醇化HSA脱盐，并使用BCA法测定其浓度。

接下来对天然和聚乙二醇化的HSA进行了分析，结果显示聚乙二醇-HSA的生物半衰期延长了2.2倍，且血管通透性降低。

本研究的结论与前人的研究结论相同。分子均一的聚乙二醇-HSA在毛细血管通透性增加的相关疾病中可作为比较优良的血浆容量扩张剂。

在2013年晚些的时候，X Shang等人在含有10 mM硼氢化钠的100 mM乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中，加入摩尔比为4：1的聚合物与蛋白质，室温20 h的条件下，在小的摇动烧瓶中使用P1PAL-10（mPEG-丙醛）在HSA的N-端氨基上进行聚乙二醇化。他们利用疏水相互作用膜层析法对亲水性聚偏氟乙烯膜片进行叠置，分离未改性和聚乙二醇化的HSA。通过向HSA聚乙二醇化反应混合物中加入易溶的盐，引发不同分级物质之间的疏水性差异，这使聚乙二醇（在正常条件下为亲水性）相变为温和疏水的。 结果，通过降低盐浓度首先洗脱单聚乙二醇化的HSA。SDS-PAGE，动态光散射和SEC结合多角度光散射已经证明存在具有与单聚乙二醇化HSA分子量一致的物质。

多聚乙二醇化

HSA中6个自由生成硫醇的位点的多聚乙二醇化:Pedro Cabrales等比较了Hexa聚乙二醇化HSA (聚乙二醇-Alb)恢复血管内容量的效果。为了产生Hexa聚乙二醇化的HSA，他们将HSA与2-亚氨基硫代烷(2-IT)和马来酰亚胺苯基聚乙二醇5K (MPPEG5K)在低温下反应过夜，这被称为硫代化介导的马来酰亚胺化学反应，如图2所示。

根据该反应的结果和HSA浓度与2-IT浓度的比值，通过4-PDS方法估算出在HSA表面上产生6个游离硫醇。他们将HSA上巯基和2-IT按过剩的3倍摩尔比例与MPPEG5K反应。

为了去除多余的2-IT和MPPEG5K，他们使用微型切向流动过滤仪对反应产物进行了50K MW微孔滤膜对PBS(pH 7.4)的透析，并定期通过尺寸排阻色谱法对截留物进行监测，进而确定完全除去了反应物。然后使用Amicon公司的浓缩器在4％加压氮气的情况下将最终产物浓缩，截留物用0.22mu;M的Millipore过滤器对其进行除菌之后，使用Bradford蛋白质测定方法测定聚乙二醇化HSA的浓度。

核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）结果证实平均6个PEG5K链与一个HSA分子连接。六聚乙二醇化HSA，5％HSA（HSA5）和10％HSA（HSA10）的胶体渗透压（COP）分别约为48 mmHg，22 mmHg和46 mmHg；它们的粘度在150 s-1时分别约为2.08 cp、 0.9 cp和 1.0 cp。

作者认为，因为它的血液动力学功能很好，聚乙二醇-Alb可能是一个更好的复苏方案，但HSA也有潜在的缺点。

在HSA主要反应性伯氨基上的多聚乙二醇化：Fantao Meng等人通过加入10倍摩尔量的3kDa和5kDa的聚乙二醇-苯基-异硫氰酸酯（PIT-聚乙二醇），在pH 6.5和9.2条件下与0.5mM HSA生成聚乙二醇化的人血清白蛋白（聚乙二醇-HSA），每个HSA分子平均具有3.5和6.0个聚乙二醇链。通过双官能团试剂4-异硫氰酸基苯基异氰酸酯与单甲氧基聚乙二醇（mPEG）的缩合合成PIT-聚乙二醇。这种聚乙二醇在差不多6.5至9.5的pH下容易与氨基反应。

圆二色（CD）光谱显示聚乙二醇化对HSA二级结构的影响不显著。4％HSA的流体动力学半径（分子半径）、黏度和溶液胶体渗透压在pH 9.2比（TCP-聚乙二醇5K）6-HSA都高（表2）。基于这些结果，聚乙二醇-HSA偶联可以作为血浆容量扩充剂的潜在替代物。

固相聚乙二醇化

聚乙二醇化的固相吸附方法由Xiaoyan Suo等人开发，用以制备均相聚乙二醇化蛋白质。固相聚乙二醇化的优点之一是能控制聚乙二醇化过程，使固相聚乙二醇化受到空间位阻的作用而产生均相聚乙二醇化蛋白。另一方面，由于这种位阻效应，以及缺乏多聚乙二醇化产物，这种方法的聚乙二醇化收率较低。但上述优点是相当重要的，因为在净化步骤中，由于聚乙二醇数和附着位置的不同，避免了重叠峰的干扰。

Xiaoyan Suo的课题组在他们的实验中使用HSA（pI 4.7）作为模型蛋白。他们以阴离子交换层析介质（AEC介质）和DEAE Sepharose Fast Flow作为固定相吸附蛋白质，将5 mL AEC固定相和1 mL 1 mg/mL的HSA（10 mM PBS pH 7.0）混匀。然后，聚乙二醇化蛋白在室温下与由碳酸琥珀酰亚胺(SC)-mPEG5K(摩尔比为1:10)装载的纯化柱一起孵育4小时。在洗脱时，用含有0-1 M NaCl线性梯度缓冲液A在60 min以上洗脱聚乙二醇化的HSA。

他们分析了未反应蛋白和聚乙二醇化蛋白混合物在Superdex 200或75柱上的洗脱峰，在色谱图上比原来的图多出现一个洗脱峰，而在液相聚乙二醇化样品上比原图多出现两个主要的洗脱峰。

SDS-PAGE和尺寸排阻色谱研究表明，固相吸附法避免了聚乙二醇化产物的异质性（在液相聚乙二醇化方法中，单聚乙二醇化蛋白质产率为35-47％，相比之下，70％的聚乙二醇化产物包括单- ，二- 或多- 聚乙二醇化蛋白质）。 使用圆二色性和内在荧光研究也表明聚乙二醇化蛋白的构象变化很小。

聚乙二醇化HSA的纯化与分析

所有分析方法及研究目的见

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