Clostridium autoethanogenum在没有乙酸积累的生物反应器中，将一氧化碳发酵成乙醇外文翻译资料

 2021-12-02 10:12

英语原文共 6 页

Clostridium autoethanogenum在没有乙酸积累的生物反应器中，将一氧化碳发酵成乙醇

摘要：CO或合成气的发酵为生产生物乙醇提供了一条有吸引力的途径。然而，在生物转化过程中，需要克服的挑战之一是减少乙酸的产生，以最大限度地降低回收成本。对Clostridium autoethanogenum进行了不同的实验。添加0.75mu;M钨后，在分批模式下，与未添加此类添加剂的对照相比，由一氧化碳生产乙醇增加了约128 %。在连续供应一氧化碳的生物反应器中，在pH 6.0时达到的最大生物量浓度是pH 4.75时达到的最大生物量浓度的109 %，但有趣的是，在pH 4.75时，没有产生乙酸，乙醇效价在少量2，3 -丁二醇( 46 mg/L )的情况下达到最大值867 mg/L。在连续气体进料生物反应器中研究的较高pH值( pH 6.0 )下，几乎形成等量的乙醇和乙酸，分别达到907.72毫克/升和910.69毫克/升。

关键字：生物乙醇 丁二醇 硒 合成气 钨

1 引言

近年来，随着全球石油储备的逐渐枯竭和对气候变化的共识，人们对生物燃料的使用越来越感兴趣。到2020年，欧盟所有成员国都必须达到能源方面的既定目标，并实现20 %的可再生能源份额( van Groenestijn等人，2013年)。此外，到那时，所有MS都必须在运输中使用10 %的可再生能源( Latif等人，2014年)。生物乙醇是生物燃料之一，在2012年欧盟道路运输中占总生物燃料的28 %。预计2014年欧盟生物乙醇产量将达到53.8亿升( Flach等人，2013年)。小麦、玉米、大麦和黑麦等谷物目前是欧盟生物乙醇生产的主要原料。然而，这导致了食物燃料的竞争。因此，克服这种情况的一种方法是利用高度可用的木质纤维素生物质，甚至废物作为生产生物乙醇的原料。然而，木质纤维素生物质生物转化为生物乙醇的传统方式是一个有点复杂的过程( Balat和Balat，2009年)。另一种有希望的新一代生物乙醇生产工艺是通过生物质气化来产生合成气或生产气体，主要由CO、CO2和H2组成。它随后被引入发酵罐，在特定的工艺条件下接种厌氧细菌，主要属于梭菌属( Abubackar等人，2011a；Bengelsdorf等人，2013年；Mohammadi等人，2011年)。生物催化剂使用这些C1化合物作为唯一的碳源，遵循还原乙酰CoA途径，导致乙醇和乙酸的产生。据报道，发酵过程中还会产生微量的2，3 -丁二醇、丁醇和乳酸( Bengelsdorf等人，2013年)。最近，一些关于合成气发酵用基因工程生物催化剂的研究也发表了( Ueki等人，2014年；谢等人，2015年)。另一方面，仍在对野生型细菌菌株进行研究，以通过操纵几个参数来提高乙醇产量，例如培养基组成或发酵罐操作条件( Abubackar等人，2012年；Kundiyana等人，2011年)。

还原乙酰辅酶a途径，也称为Wood-Ljungdhl( WL )途径，包括一个东方或称甲基分支和一个西方或称羰基分支，它们使用CO或CO2作为合成乙酰辅酶a的底物，乙酰辅酶A是一种中间体，作为生物量和代谢物如乙醇和乙酸形成的前体。参与WL途径的蛋白质需要辅因子，如H4-叶酸、钴胺素、金属离子或FeS -簇。例如，柯林型FeS蛋白既含有带有中心钴原子的钴胺素，也含有FeS簇。来自Moorella thermoacetica和Acetobacterium woodii的一氧化碳脱氢酶( CODH )含有两个Ni-FeS簇。M. thermoacetica 的催化CO2还原成甲酸盐的甲酸脱氢酶( FDH )，是一种含金属酶的钨、硒和FeS簇的金属酶、( Ragsdale和Pierce，2008年)。

到目前为止，大多数关于CO生产乙醇的研究都集中在各种宏观营养物质(如氮源)及其浓度如何影响发酵过程。几乎没有任何研究关注痕量金属如何影响乙醇的生产，也没有研究过它们在连续供给气态底物的生物反应器中的影响。一项研究已经发表，但是是分批测定，没有pH控制( Saxena和Tanner，2011年)。因为钨和硒是甲酸脱氢酶( FDH )的组分，而醛:铁氧还蛋白氧化还原酶( FOR )催化羧酸还原成醛是含钨酶(图1) (Wang等人，2013年)，本研究的目的是研究钨和硒对产自乙醇梭菌发酵CO以及分批和连续气体进料生物反应器中产品分布的影响。还研究了维生素的存在和pH值的影响。

图1 Wood - Ljungdhl途径和乙酰CoA代谢物的形成，以及相应的金属酶。缩写：FDH，甲酸脱氢酶 ； AFOR，甲醛:铁氧还蛋白氧化还原酶。

2 方法

2.1.瓶子分批实验

在没有pH控制的情况下进行了批量实验，以研究微量金属、钨( W )、硒( Se )以及维生素对自动乙醇发酵菌DSM 10061生长和产物形成的影响。用于维持细菌的生长培养基以及用于批量实验的生产培养基在表1中给出。如下所述，用不含维生素的具有不同痕量金属成分的生产培养基重复进行五次独立测试: ( 1 )痕量金属SL – 10溶液中不含不含W和Se [TM] ( 2) SL-10溶液中含有0.075mu;mol 钨 (指测试小瓶中的钨离子浓度) [低钨]；( 3) SL-10，含0.144mu;mol硒离子[低硒]；( 4) SL-10中含有0.75mu;mol 钨离子[高钨)和( 5) SL-10中含有1.44 mu;mol[高硒]。另一组四项实验一式两份进行，以检查额外维生素( Vit )对CO生物转化的需要和影响: (1) SL-10和Vit [ Vit ]；( 2) SL-10，含0.75mu;mol W和Vit [ W - Vit ]；( 3) SL-10，含1.44mu;molSe和Vit [ Se - Vit ]；( 4) SL-10，带0.75mu;mol 钨 和1.44mu;mol 硒 以及Vit [ALL)。每升生产培养基使用1 ml维生素溶液(表1 )进行维生素( Vit )实验。

表1 实验中使用的培养基成分。

生长培养基( pH 6 )

成分(每升蒸馏水) : NH4Cl，0.9g；氯化钠，0.9g ；MgCl 2·6H2O，0.4g ；KH2PO4，0.75g；K2HPO4，1.5g；FeCl3·6H2O，0.0025g；胰蛋白酶蛋白胨，2.0g；酵母提取物，1.0g；半胱氨酸盐酸盐，0.75g；0.1 %刃天青，0.5ml；用0.5 %木糖和SL-10溶液，1.0 ml。微量金属储备溶液SL-10含有(每升) : 7.7 M HCl，10 mLFeCl 2·4H2O，1.5g；四水合氯化锰，100mg；H2BO3，6mg；CoCl 2·2H2O，190mg；CuCl2·2H2O，2mg；NiCl2·6H2O，24mg；和Na2MoO4·2H2O，36mg

生产培养基（PH 5.75）

成分(每升蒸馏水) : NaCl，0.9g；MgCl 2·6H2O，0.4g；KH2PO4，0.75g；K2HPO4，1.5g；酵母提取物0.5g；FeCl3·6H2O，0.0025g；0.1 %刃天青，0.5ml；半胱氨酸-HCl 0.75g和SL-10溶液，1.0ml

维生素原液含有(每升) 10ml对氨基苯甲酸、泛酸钙、烟酸、核黄素、硫胺素、alpha;-硫辛酸和维生素B12，4mg d -生物素、叶酸和20mg吡哆醇

钨和硒

所使用的化学品是Na2WO4 ·2H20和Na2SeO3

在初始pH为5.75的100 ml血清小瓶中，用30 ml生产培养基进行两次研究，并用2.5 ml活性生长种子培养物接种，该种子培养物以CO作为唯一碳源生长。瓶子保持在厌氧条件下。用100% CO将它们加压至1.2bar，并在30℃的轨道培养箱中以150 rpm搅拌。用于培养基制备和取样细节的实验装置和方法在别处有所描述( Abubackar等人，2011 b )。

2.2. 钨连续供气生物反应器实验

在pH 6.0 (高pH )或pH 4.75 (低pH )的2-L新不伦瑞克科学生物反应器中，以1.2 L分批液体培养基和CO (100% )作为气态底物，进行了两次生物反应器实验，使用质量流量控制器( alborg GFC 17 )以10 ml/min的速率连续进料。用于实验的培养基成分与含有0.75mu;mol W的痕量金属溶液的分批试验中的培养基成分相同，因为这表明在分批试验中有利于所需的生物转化途径。在整个实验中，生物反应器保持在30℃的恒定温度，恒定搅拌速度为250 rpm。将10 %的以CO为唯一碳源生长48小时的活性生长培养物用作接种物，并无菌转移到生物反应器中。通过添加2 M NaOH或2 M HCl溶液，通过蠕动泵进料，培养基的pH值自动保持在6.0或4.75的恒定值。从生物反应器的入口和出口取样口采集0.2 mL气体样品，以监测CO和CO2浓度。类似地，为了测量光密度(ODlambda; = 600 nm )并估计生物量浓度，每24小时从反应器中定期取出2 mL液体样品一次。之后，在分析可溶性产品的浓度之前，用注射器用0.22mu;m PTFE过滤器过滤样品。

2.3。分析设备和测量协议

使用配备热导检测器( TCD )的HP 6890气相色谱仪( GC )测量气相CO浓度。GC装有15 m HP-PLOT分子筛5A柱( ID: 0.53 mm，膜厚: 50mu;m)。烘箱温度最初保持恒定在50℃，持续5分钟，然后升高20℃，持续2分钟，达到90℃的最终温度。注入口和检测器的温度保持恒定在150℃。氦气用作载气。同样，在配备TCD的HP 5890气相色谱仪上分析CO2。注射、烘箱和检测温度分别保持在90、25和100℃。为了识别2，3 -丁二醇，使用了热科学ISQ单四极杆GC - MS系统，在70 eV下运行，安装有HP-5 ms柱( 30 m times; 0.25 mm times; 0.25mu;m膜厚)。使用HPLC (美国安捷伦公司HP1100 )分析培养液中的水溶性产物乙酸、乙醇和2，3 -丁二醇，该HPLC配备了5mu;mtimes; 4 mm times; 250 mm Hypersil ODS柱和波长为284 nm的UV检测器。流动相是以0.5 ml/min的流速进料的0.1 %正磷酸溶液。色谱柱温度设定为30℃。通过使用紫外可见分光光度计( Hitachi，U-200型，西班牙马德里Pacisa amp; Giralt )测量样品在600 nm波长下的吸光度，估算细胞质量。然后将测得的吸光度与先前生成的校准曲线进行比较，以计算相应的生物量浓度( mg/L )。此外，使用保持在生物反应器内并连接到变送器的Ag/AgCl参比电极连续监测氧化还原电位( M300，梅特勒-托利多，美国公司)。

3. 结果与讨论

3.1. 瓶子分批实验

图2、图3显示了两组实验的乙醇/乙酸和丁二醇/乙酸比率。实验结果表明，在指定为高W的实验中，获得的最高乙醇与乙酸之比为0.19；这比高硒实验中获得的比率高173 %。从图中可以清楚地看出，在分批试验中，乙醇/乙酸的比例随着培养基中钨的存在而增加。在硒的情况下，在低硒或高硒实验中获得的比率大致相似，值为0.013 (图2a )，甚至低于对照培养基( TM )。因此，可以得出结论，硒不允许增加自动乙醇发生菌中乙醇/乙酸的比例。与对照培养基相比，它甚至不太有利于乙酸的生产。最近一份关于另一种细菌菌株在分批试验中的研究报告与目前的发现一致，并表明培养基中含硒或不含硒的醋酸产量没有显著变化( Saxena和Tanner，2011年)。

图2.( a )乙醇/乙酸比和( b )丁二醇/乙酸比，在没有维生素的情况下获得。TM =不含硒和钨的微量金属溶液。误差条代表标准偏差。

图3.( a )乙醇/乙酸和( b )丁二醇/乙酸比，在维生素存在下获得。All =硒、钨以及维生素的存在。误差条代表标准偏差。

一些参与WL途径及其后导致代谢产物产生的途径的钨酸酶包括甲酸脱氢酶( FDH )和醛:铁氧还蛋白-氧化还原酶( FOR )，其活性位点为蝶呤辅因子(图1 )。FDH催化WL途径中的第一个反应，即CO2双电子还原成甲酸酯( Ragsdale和Pierce，2008年)。第一个最初分离的钨酶是来自嗜热梭状芽孢杆菌的FDH。每二聚体含有1个钨原子、1个硒、18个铁和约25个无机硫，并利用NADPH作为生理电子载体( Yamamoto等人，1983年)。据报道，生长培养基中钨、硒、钼和亚铁离子的存在刺激了FD

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