通过将各种CRISPR/Cas9载体DNA显微注射到冻融的受精卵中,产生敲除小鼠外文翻译资料

 2022-07-22 12:07

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通过将各种CRISPR/Cas9载体DNA显微注射到冻融的受精卵中,产生敲除小鼠

背景:规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)介导的基因组编辑可以实现基因工程小鼠的快速生产｡为了充分利用这一创新技术,对(CRISPR)/CRISPR载体的健壮构造､对小鼠卵母细胞的有效准备和改良的基因型策略,这需要一种简化的程序｡虽然我们以前演示过卵母细胞冷冻保存技术和各种基因分型方法在生产中的适用性转录激活子样效应子核酸酶介导的小鼠基因组编辑,尚未得到澄清这些技术可以应用于CRISPR/Cas9介导的敲除小鼠的产生｡在这项研究中,我们研究使用几个CRISPR/Cas9系统创建敲除小鼠的简单,高效和可靠的方法｡

结果:我们构建了三种类型的CRISPR/Cas9载体,其表达:1)引导RNA(gRNA)和Cas9核酸酶2)两个gRNA和Cas9切口酶以及3)两个gRNA和FokI-dCas9,靶向相同的基因组｡这些载体直接显微注射入冻融受精卵母细胞,并存活卵母细胞转移到假孕ICR小鼠｡Cas9核酸酶导致最高的突变率最低出生率,而Cas9切口酶导致出生率最高,突变率最低的FokI-dCas9呈现平衡良好的突变和出生率｡此外,我们构建了一个单一的一体式FokI-dCas9载体靶向两个不同的基因座,并通过囊胚分析验证其功效,导致高度的变异有效的同时靶向诱变｡

结论:我们的报告提供了研究人员友好的综合程序选择CRISPR/Cas9介导的敲除小鼠,具有先进的施工系统,适用于各种类型的CRISPR载体,方便制备体外受精或交配的冻融卵母细胞,以及有效的突变筛选方法｡

关键词:敲除小鼠,原核显微注射,体外受精,冻融,CRISPR/Cas9,FokI-dCas9

背景

近几十年来,基因工程小鼠(GEM)在阐明特定基因的功能,疾病机制,胚胎发生和差异表达方面起着重要的作用｡尽管全世界都有大量的基因工程小鼠被制造和分析,但是仍然有一种更有效的需求生成新的基因工程小鼠的方法｡使用可编程核酸酶的基因组编辑,如锌指核酸酶(ZFN),转录激活物样效应核酸酶(TALENS)以及聚集的定期交织的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)是产生GEM的简单有效的策略｡特别地,由于其简单的构建和高DNA双链断裂(DSB)诱导活性,CRISPR/Cas9提供了最方便的方法去产生GEM｡传统的CRISPR/Cas9系统由Cas9核酶和单导RNA(gRNA)组成,目标是一个指定的基因组位点,包含由gRNA定义的20个碱基序列,以及由Cas9定义的一个原始间隔基(PAM)序列,然后这个复合物裂解双链DNA｡DSBs主要由易出错的非同源端连接(NHEJ)修复,随机诱导插入或删除,从而导致有针对性的基因中断｡

传统的CRISPR/Cas9复合物不像ZFN和TALENS那样形成二聚体,并且它通常导致高频失靶突变｡据报告,虽然动物胚胎,特别是小鼠和大鼠的胚胎,异常突变的频率不是很高,但它们确实存在,因此即使在动物中也存在潜在的风险｡ 为提高特异性,已经开发了两种衍生技术;使用Cas9切口和FokI二聚化的双切口使用与FokI(FokI-dCas9)融合的核酶缺陷型Cas9｡在两种策略中,配对的gRNA用于在目标基因组座位的并置位置上吸引两个Cas9切口分子或FokI-dCas9,导致DNA切割｡重要的是,单个gRNA引导的Cas9切口酶只能诱导缺口,其比DSB诱变更少｡此外,单gRNA引导的FokI-dCas9完全不损伤基因组的DNA｡因此,这两种衍生策略的脱靶突变显着降低｡

为了使用CRISPR/Cas9系统产生敲除小鼠,Cas9mRNA和gRNA通常使用体外转录合成并用于显微注射｡然而,MAshIkO及其同事描述了使用表达Cas9和gRNA的环状质粒的原核显微注射的简化方案｡直接使用质粒避免了费力的体外转录和纯化步骤的需要,并且质粒与RNA相比提供高稳定性,使得能够强大地产生敲除小鼠｡此外,我们最近建立了一个一体化CRISPR/Cas9载体系统,用于在单个载体中组装多个gRNA盒和Cas9核酸酶/切口酶盒｡结合这些方法,已经认为可以实现由成对的gRNA引导的CRISPR系统介导的敲除小鼠的有效生产｡

关于用于显微注射以产生具有基因组编辑技术的敲除小鼠的卵母细胞的制备,通常通过交配雄性小鼠和超排卵的雌性小鼠来收集受精卵母细胞｡然而,为每个实验准备新鲜的受精卵,是耗时且费力的工作｡我们以前已经建立了一种使用由体外受精(IVF)产生的冻融受精卵母细胞进行TALEN介导的敲除小鼠的产生的过程,以及关于转基因小鼠产生的报道｡此外,李和同事最近报道,由IVF产生的新鲜受精卵可以用于传统的CRISPR/Cas9介导的小鼠基因组编辑｡然而,HAN及其同事报道,他们未能用CRISPR/Cas9质粒原核注射产生基因组编辑的小鼠,而细胞质注射Cas9mRNA和纯化的gRNA成功导入基因组编辑｡因此,冷冻保存和IVF技术对各种CRISPR系统的适用性是建立流式化CRISPR/Cas9质粒注射介导的敲除小鼠生产的另一个重要进展｡

在这里,我们扩大多重gRNA装配体系,包括FokI-dCas9,并构建Cas9核酸酶,Cas9缺口酶和FokI-dCas9型载体,用于产生敲除小鼠｡每个系统的gRNA被设计为靶向内源基因的相同位点,并且进行出生率和突变率的比较｡还研究了冷冻保存和IVF的适用性｡我们进一步检查了原核注射表达FokI-dCas9和四个gRNA的单一一体质粒是否可以在小鼠胚胎中实现多重基因组编辑｡

结果讨论

构建用于FokI-dCas9介导的基因组编辑的一体化载体系统｡

我们以前建立了一个创建表达Cas9核酸酶或切口酶和多达七个gRNA的一体化CRISPR/Cas9载体的系统,并通过载体(KIt)将这些质粒分布为“多元化CRISPR/Cas9组装系统试剂盒”｡为扩大FokI-dCas9介导的基因组编辑系统,我们首先创建了PX330A_FokI-1X载体｡使用这些新构建的质粒和包含在AddgeNe试剂盒中的PX330s载体,我们可以为FokI-dCas9介导的基因组编辑创建一体化载体,不仅用于单一的,而且用于多重基因编辑｡预计新载体将由AddgeNe分发,作为当前套件的补充包(多重CRISPR dCas9/FokI-dCas9附件包)｡

设计CRISPR/Cas9核酸酶,Cas9缺口酶和FokI-dCas9载体靶向白细胞介素-11(IL11)基因

为了比较三种CRISPR/Cas9系统与Cas9核酸酶,Cas9缺口酶还有FokI-dCas9在小鼠基因组编辑中的适用性,我们设计并构建了如图2所示的CRISPR/Cas9载体｡虽然三个系统需要不同的设计参数而且难以将基因组编辑功效与完全相同的gRNA进行比较,但是我们尝试将目标几乎与IL11基因的外显子3相同的基因组区域｡对于Cas9核酸酶,在外显子内设计了两个gRNA:gRNA_A和gRNA_B,并分别克隆了这些gRNA的寡核苷酸｡对于Cas9切口酶,gRNA_B和gRNA_C被设计为具有7-bp偏移｡当诱导双缺口介导的基因组修饰时,偏移长度的最佳范围约为10bp,而FokI-dCas9需要13至18 bp的偏移才能进行高效的靶向诱变｡因此,我们设计了另一种gRNA,gRNA_d,与gRNA_B结合用于FokI-dCas9｡

一体化FokI-dCas9载体的活性验证

由于含有FokI-dCas9盒的一体载体的基因组编辑潜力未知,我们评估了小鼠胚胎中FokI-dCas9_BD载体的活性｡将FokI-dCas9_BD载体显微注射到小鼠受精卵母细胞的原核中｡将21个存活卵母细胞培养3.5天｡我们观察到7个囊胚,其中6个发育成扩展的囊胚｡将每个囊胚收集到微管中,然后进行PCR扩增靶向位点｡我们证实通过直接测序在三个胚胎中诱导了至少一个突变｡此外,PCR产物的细菌克隆,然后进行DNA测序显示高突变率(ge;50%),证实了一体化FokI-dCas9载体在GEM生成中的强大潜力｡

通过显微注射一体CRISPR/Cas9质粒转化为冻融受精卵母细胞

我们接下来将三种类型的CRISPR/Cas9载体进行显微注射,注射到冻融的受精卵中,用于基因工程小鼠的有效和方便的建立｡使用生殖工程技术,如IVF和冻融,可以高效率获得受精卵母细胞｡将每个CRISPR/Cas9载体直接注射到通过交配或IVF制备的冻融受精卵中的原核｡显微注射后的存活卵母细胞转移到假孕ICR雌性小鼠的输卵管中｡所有替代雌性小鼠产生幼仔,并且通过直接测序分析将不包括死亡幼崽的所有幼崽进行基因分型｡虽然我们已经表明组合筛选策略是完整基因分型所必需的,但据报道直接测序能够提高突变率筛选突变小鼠｡

测序分析显示,所有三种类型的CRISPR/Cas9载体均可产生突变小鼠,但每种方法的出生率和突变率均无法比较｡在Cas9核酸酶组中,出生率相对较低(7.4-12.0%),突变率高(80-100%)｡相反,Cas9切口组(19.1%和22.2%)出生的幼崽更多,而Cas9核酸酶组(5.9%和0%)的突变体数量少｡有趣的是,FokI-dCas9组的出生率分别为18.2%和17.6%,突变率分别为66.6%和33.3%｡为了证实FokI-dCas9介导的方法的优越性,我们另外将FokI-dCas9_BD载体注射到与雄性小鼠配对的成熟雌性小鼠(8周龄)收集的冻融受精卵中｡与使用从未成熟雌性小鼠(5周龄)收集的卵母细胞的结果一致,出生率和突变率足够高(分别为38.2%和84.6%)｡这些结果不仅表明FokI-dCas9介导的小鼠基因组编辑的稳健性,而且还表明了使用来自不同周龄的雌性小鼠的卵母细胞的适用性如前所述一样｡尽管这些结果并不一定反映了三种CRISPR/Cas9系统的一般性质,但它们代表了CRISPR/Cas9介导的GEM生成的重要实例｡重要的是,Cas9核酸酶质粒注射小鼠的低出生率与使用近交系的先前研究相当,尽管使用B6d2F1(BDF1)杂交小鼠可以实现高出生率｡因此,我们得出结论,FokI-dCas9质粒注射可能是产生敲除小鼠的强大策略,特别是对于近交系｡

转基因和非靶向分析

由于质粒DNA需要用于显微注射,我们调查DNA载体是否整合到基因组中｡将Cas9变体和FokI编码序列的基因组进行PCR检测基因组整合体｡ 在通过注射Nuclease_B载体产生的两个母体中,Cas9基因片段被扩增｡总共10%(2/20)的突变小鼠携带转基因｡虽然观察到的转基因性略高于 Mashiko的报告(4.3%),但这可能不是一个主要问题,因为转基因可以在突变菌株扩增前通过交配去除｡

最后,通过直接测序分析每个gRNA靶位点的潜在脱靶位点｡使用CRISPR设计工具选择了每个站点的前三名候选物｡然后,我们对20个创始者物(Nuclease_A的七名创始物,Nuclease_B的六名创始物,Nickase_BC的一名创始物,以及FokI-dCas9_BD的六名创始物)进行了排序,但没有检测到非目标突变｡然而,我们的分析和所有以前报告的小鼠脱靶分析提供了基因组背景有限,并且不可否认的是在基因组的不同部分中的靶外诱变的潜在风险｡事实上,TsAI及其同事最近透露,CRISPR/Cas9可以诱导多种基因组重排,包括培养细胞中的巨型大规模大缺失和染色体易位｡他们还表明,大多数这些实验证明的离靶目标没有被使用包括CRISPR设计工具在内的任何计算预测工具识别为离靶目标｡同样在小鼠中,这些隐藏的脱靶效应可能存在,但是由于不能通过计算机分析来预测,因此难以检测｡因此,我们认为,高度特异性的基因靶向策略,如FokI-dCas9,不仅对于培养的细胞应用而言也是重要的,而且也对于创造GEM｡

使用单一的一体式FokI-dCas9载体在小鼠胚胎中进行多重基因组编辑

我们最后检查是否可以使用单一的一体式FokI-dCas9载体的显微注射来应用多种基因靶向,同时表达四种gRNA和FokI-dCas9｡我们设计gRNAs靶向再生岛胰岛3beta;和再生岛3gamma;基因的外显子3,它们位于第6号染色体上,距离为96.1kb｡将一体式FokI-dCas9载体显微注射到受精卵母细胞的原核中｡培养28只存活卵母细胞3.5天,将9只胚胎发育成囊胚｡将每个囊胚收集到微管中,然后进行PCR以扩增两个靶基因座周围｡直接测序分析显示,超过50%的胚胎在两个靶基因座中都具有突变等位基因｡更重要的是,五个胚胎在两个基因中都具有突变,显示出通过显微注射一体化FokI-dCas9载体介导的双重敲除小鼠的高潜力｡我们进一步进行了PCR,以研究是否存在染色体缺失的等位基因,但是没有使用囊胚PCR基因分型观察到所需的扩增子｡进一步的检查是为了澄清幼虫中可能存在染色体缺失的等位基因｡

结论

我们的研究比较了通过一体化载体系统构建的表达gRNA和Cas9核酸酶,Cas9切酶或FokI-dCas9的各种CRISPR/Cas9载体显微注射的单细胞小鼠胚胎的基因组编辑效率｡此外,我们展示了通过上述方法介导的IVF和GEM生成中卵母细胞冻融的适用性,这使得受精卵中的卵母细胞的制备更加方便｡我们的研究结果表明,FokI-dCas9介导的方法是创建GEM的高度可靠的策略,包括双重敲除小鼠,我们为基于CRISPR/Cas9的创业板一代提供可访问的平台｡

方法

质粒

如前所述,使用多重 CRISPR/Cas9装配系统试剂盒构建Cas9核酸酶和缺陷酶的一体式CRISPR/Cas9载体｡对于FokI-dCas9载体,使用反向PCR和融合融合克隆方法在PX330A_d10A载体中引入H840A突变｡随后,使用FokI-dCas9-INs-F和FokI-dCas9-IN-R引物,通过PCR从包含在 Platinum Gate TALEN试剂盒中的ptCMV-136/63-vR载体通过PCR扩增FokI的编码序列列在附加文件5中｡使用 In-Fus

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