葫芦素E葡糖苷抑制睾丸激素诱导的小鼠前列腺增生外文翻译资料

 2022-08-09 09:08

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葫芦素E葡糖苷抑制睾丸激素诱导的小鼠前列腺增生

[摘要] 良性前列腺增生(BPH)是一种常见的男性疾病，对于年龄在60岁以上的男性，BPH可导致痛苦的下尿路症状。葫芦素是一种三萜衍生物，具有多种药用价值，包括治疗前列腺疾病。葫芦素E葡糖苷与睾丸激素诱导的小鼠前列腺增生进行了对照研究。我们的数据表明，它明显抑制了前列腺重量和前列腺指数的增加。该化合物改善前列腺结构的组织病理学改变，抑制睾酮诱导的腺上皮长度增加。与单独睾酮组相比，前列腺组织中cyclin D1表达降低，证实了上述结果。此外，通过抑制脂质过氧化物的积累、谷胱甘肽的消耗和超氧化物的消耗，也显示出明显的抗氧化活性。此外，前列腺组织中环氧合酶-2和白细胞介素-1b蛋白的表达降低，显示出抗炎活性。马氏三色染色前列腺切片显示明显的抗纤维化活性，这是由a-平滑肌肌动蛋白表达降低所支持的。综上所述，葫芦素E葡糖苷至少在一定程度上由于其抗增殖、抗氧化、抗炎和抗纤维化作用而抑制睾丸激素诱导的小鼠实验性前列腺增生。

[关键词] 葫芦素E葡糖苷；良性前列腺增生；睾酮；抗增殖；抗纤维化

  1. 引言

良性前列腺增生(BPH)是前列腺的过度生长。前列腺增生通常与泌尿功能损害有关。它是世界上最常见的影响老年男性的前列腺增生异常。据报道，80岁的男性中80%患有BPH (Nandecha et al. 2010)。前列腺组织损伤和氧化应激促进增生，最终导致增生生长(Minciullo et al. 2015)。据报道，前列腺肿大与炎症有关。氧化应激、慢性炎症和纤维化与BPH的发病机制有关(Gandaglia et al. 2013, Minciullo et al. 2015, Bushman and Jerde 2016)。

葫芦科共有125属960种。它包括著名的食用植物，如黄瓜(Cucumis sativus)、小黄瓜(gherkin)、甜瓜(Cucumis melo)、南瓜(Cucurbita pepo)和冬瓜(Cucurbita maxima) (Rios et al. 2005, Ayyad et al. 2012)。属于葫芦科的可食用果实是普遍存在的，被认为是葫芦三萜衍生物的重要来源(Hussain et al. 2014, Kaushik et al. 2015)。由于它们具有广泛的生物活性，它们引起了人们极大的兴趣。这些生物活性包括抗增殖、抗氧化、抗炎和抗纤维化活性(Spitz et al. 2007, al - snafi, 2016)。甜瓜果实提取物具有体内外抗氧化活性(Rajasree et al. 2016)。瓜蒌水提物具有明显的抗炎作用，可显著抑制炎症模型大鼠的肿胀和水肿(Hussain et al. 2014)。从药西瓜瓤中分离出的葫芦素通过诱导细胞凋亡抑制人乳腺癌细胞的生长和增殖(Al-Snafi, 2016)。从药西瓜瓤中分离得到的葫芦素E和B糖苷，对人乳腺癌细胞有较强的抗增殖作用(Alghasham 2013)。此外，从药西瓜瓤中分离得到的葫芦素E和I糖苷，对人肝癌细胞具有抗增殖活性(HepG2) (Ayyad et al. 2012)。分别从药西瓜中分离得到葫芦素E、B、D和I，对不同的人癌细胞株的增殖有抑制作用(Jayaprakasam et al. 2003)。本研究的目的是分离和鉴定葫芦素三萜的主要成分，并评估其对睾丸激素诱导的小鼠BPH的潜在保护作用。

  1. 材料与方法
    1. General

使用硅胶60 (0.04-0.063mm, Merck, Kenilworth, NJ) (np -二氧化硅)、Sephadex LH-20 (0.25-0.1mm, Merck, Kenilworth, NJ)和RP-18 (0.04-0.063mm, Merck, Kenilworth, NJ)进行代谢物的分离。对购自德国Macherey-Nagel GmbH amp; Co. KG公司的预涂覆的TLC硅胶60G F254进行TLC分析。在BRUKER Unity INOVA 850仪器(BRUKER BioSpin, Billerica, MA)上进行了核磁共振波谱分析。所有使用的化学药品和溶剂均购自德国斯坦海姆的西格马尔德里奇。

    1. 植物样本

瓜蒌(L.)是2015年5月在沙特阿拉伯麦加周围的沙漠中收集的。这种植物是由Emad Al-Sharif博士(沙特阿拉伯阿卜杜勒阿齐兹国王大学Khulais科学和艺术学院生物系)鉴定的。一个证据标本(CC 2015-1)在沙特阿拉伯国王阿卜杜勒阿齐兹大学自然产品和替代医学标本室存档。

    1. 提取和分离

Citrullus colocynthis (L.)干果（1.8kg）在23℃下被甲醇（6L*3）充分浸提。浸膏干燥后，得到一种深棕色的粘稠物质(118.0g)。甲醇提取物使用CH2Cl2和EtOAc连续分离得到三个馏分: CC1 (19.5g, CH2Cl2)， CC2 (9.1g, EtOAc)，其余CC3 (85.0g, H2O)。采用不同的溶剂体系进行薄层色谱分析。组分 CC2用 NP-Silica 凝胶柱层析法纯化 (450g*100cm *3cm) 用 CH2Cl2-MeOH (梯度, 从 100:0到15:85) 得到12个亚组分 (1–12). 亚组分4（504mg）经NPSilica CC (40g*50cm * 2cm, CH2Cl2–MeOH (梯度, 从 99:1 到 95:5)处理得到化合物1 (10.3mg，黄白色无定形粉末)。将亚组分5、6、7混合(3.1g)，在Sephadex LH 20CC上纯化，用MeOH-CHCl3(90:10)洗脱，得到化合物2 (1.4g，黄白色晶体)。亚组分8 (227mg)经NPSilica CC (30g*50cm* 2cm, CH2Cl2–MeOH (94:6 to 90:10))纯化得到化合物3 (21.1mg，黄色)。亚组分10 (570mg)经NPSilica CC处理(50g*50cm*2cm, CH2Cl2–MeOH (梯度, 从93:7到 85:15),得到化合物4 (16.8mg，黄色粉末)。

    1. 高效液相色谱法纯度化合物2的方法

采用高效液相色谱法测定了化合物2的纯度(Supplementary file). 采用Agilent 1200体系、溶剂输送模块、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器(DAD)、柱室(Agilent Technology，德国)组成高效液相色谱法(HPLC)测定葫芦素E糖苷的纯度。分离是一个安捷伦Zorbax Eclipse C18柱,5micro;m, 4.6times;150毫米(美国安捷伦科技)和维持在45°C。The 分析 物 被 筛选 了 使用 移动 系统 由 acetonitrile: 水 (90:10), 泵流量1mL/min；gamma;= 330 nm.检测注射量是20micro;l。

    1. 动物

所有动物实验都得到阿卜杜勒阿齐兹国王大学药学院研究伦理委员会的伦理批准(许可证编号1221439)。此外，所有的方法都是按照美国国立卫生研究院和美国农业部对实验室动物的护理和使用的指导(国家研究委员会2011)进行的。雄性SWR小鼠(4周龄，体重25-35g)来自阿卜杜勒-阿齐兹国王大学法赫德国王医学研究中心。小鼠被饲养在一个恒定的温度下（22℃plusmn;2℃，12h光照/12h黑暗）。给予小鼠一个标准的食物颗粒饮食(23%的蛋白质，3%的脂肪，7%的纤维，8%的酸不溶性灰分，1-2.5%的钙，0.9%的磷，0.5-1.0%的钠，12%的水分)和水可以随意饮用。动物在研究前在我们的设施中适应了1周。

    1. 实验设计

动物随机分为4组，每组12只雄性小鼠。简单的随机化方法是给每只老鼠一个数字(1-48)。然后，生成一个简单的表格（4列12行），并在表格中随机分配48个数字。每一列代表一个处理组。每一列对应的小鼠被分配到不同的处理组。连续处理2周。注射睾酮(5mg/ kg SC;除对照组外，其余各组每天1次，连续2周)。组1 (对照组)口服2.5ml/kg生理盐水(以Cu-E糖苷为载体)，皮下注射1ml/kg橄榄油(以睾酮为载体)。第二组给予生理盐水和5mg/kg睾酮SC诱导BPH。3、4组分别给予5、10mg/kg的Cu-E糖苷口服。最后一次注射睾酮72小时后，处死小鼠，并迅速解剖前列腺组织。将部分前列腺腹侧叶保存于10%中性福尔马林缓冲液中，进行组织学和免疫组化处理。其余前列腺组织保存于80℃，进行后续生化实验。对每组4只小鼠的前列腺进行组织学检查。所选择的剂量是基于初步的试点实验和文献(Nandecha et al. 2010, Zhang et al. 2013)。

    1. 前列腺重量和前列腺指数

每只小鼠的前列腺都被解剖出来并迅速称重。用每只小鼠的前列腺重量除以小鼠最终体重(mg/g)，计算出每只小鼠的前列腺指数。

    1. 组织病理学

简而言之，用石蜡技术对来自不同组的中性福尔马林固定前列腺组织进行处理，制备4um厚度的切片。随后进行脱蜡、复水和苏木精、伊红染色(Hamp;E)。每组处理4个前列腺，每个前列腺3个染色切片拍照，使用ImageJ软件评估前列腺腺上皮高度(Image J, 1.46a, NIH, Bethesda, MD)。另外的前列腺切片用马森三色染色法染色以评估胶原沉积。其他切片未染色进行免疫组化研究。

    1. 氧化应激标志物的测定

部分前列腺组织均质化，使用冰冷磷酸盐缓冲盐水(50mM磷酸钾，pH 7.5)。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸反应物质法(Mihara和Uchiyama, 1978)测定脂质过氧化反应。此外，使用市售试剂盒(Biodiagnostic, Giza，埃及)测定前列腺组织匀浆中还原性谷胱甘肽(GSH)含量以及过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用BCA蛋白检测试剂盒(BiovisionV R Inc.， Milpitas, CA)测定蛋白含量。

    1. 免疫组化检测Cyclin D1、环氧合酶-2 (COX-2)、IL-1b、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)

组织切片用电炉(25℃过夜)烘干，脱蜡，乙醇复水。然后在柠檬酸缓冲液(ph6.0)中加热10mM, 95℃，加热10min，得到抗原去掩蔽过程。使用细胞和组织染色试剂盒(R amp; D systems，明尼阿波利斯，MN)完成整个过程。组织切片用peoxidase阻断剂覆盖5min，用tris-buffered saline (TBS)冲洗。然后，用血清阻断剂覆盖各切片15min，再用亲和素阻断剂覆盖15min。然后将组织切片抽干，用生物素阻断剂孵育15min。用TBS清洗切片，擦去多余的缓冲液。随后，在4℃条件下将切片浸泡在一抗(1ug/ml)(抗cyclin D1，抗cox -2，抗il -1b，或antia-SMA) (ABCAM, Cambridge, UK)中过夜。使用TBS冲洗切片，然后与生物素化二抗孵育60min。然后，用TBS冲洗切片，并用高灵敏度的链霉亲和素- hpr偶联物覆盖30min。冲洗后，用DAB/AEC铬合金溶液覆盖切片5min。然后，用TBS和去离子水冲洗切片，并使用水性安装介质覆盖盖片。每只小鼠至少进行3个切片的图像分析，使用ImageJ分析软件(Image J, 1.46a, NIH, Bethesda, MD)记录并量化。

    1. 数据分析

结果采用均数plusmn;标准差表示。采用单向方差分析(ANOVA)对数据进行统计分析，采用GraphPad Instat软件version 3 (La Jolla, CA)对Tukey-Kramer进行事后检验。p值lt; 0.05为差异有统计学意义。

  1. 结果与讨论

采用不同的色谱技术(硅胶、Sephadex LH-20和RP-18)纯化乙酸乙酯可溶部分，得到4种葫芦素(1 - 4)(图1)。分离出的代谢物是通过将获得的光谱数据与之前发表的数据进行比较来鉴定的;葫芦素E(1)，葫芦素E糖苷(2- o -b-葫芦素E，Cu-E糖苷，2)，25- o -乙酰-2- o -b-葫芦素L (3)， 2- o -b- d –葫芦素I (4) (Seger et al. 2005, Chawech et al.

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