高效自愈和双重反应的纤维素基水凝胶用于控释和3D细胞培养外文翻译资料

 2022-08-13 03:08

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高效自愈和双重反应的纤维素基水凝胶用于控释和3D细胞培养

摘要

针对生物相容性和高性能的自愈水凝胶日益增长的需求，通过动态共价酰基腙键构建了一类新型的纤维素基自愈水凝胶｡合成了羧乙基纤维素-接枝二硫代二丙酸二酯和二苯并醛封端聚乙二醇，在4-氨基-苯丙氨酸（4a-Phe）催化作用下，由它们的混合溶液形成水凝胶｡通过核磁共振氢谱､傅里叶变换红外光谱､原子力显微镜､流变学和压缩测试，研究了水凝胶的化学结构､微观形貌､凝胶化时间､机械性能和自愈合性能｡通过改变聚合物的总浓度或4a-Phe含量，可以控制其凝胶化时间｡所制备的水凝胶具有良好的自愈能力，愈合效率高（asymp;96%），力学性能好｡此外，水凝胶还表现出pH/氧化还原双响应的溶胶-凝胶过渡行为，并成功地应用于阿霉素的控释｡重要的是，得益于良好的生物相容性和可逆交联网络，水凝胶可以作为L929细胞的合适3D培养支架，使封装的细胞保持较高的生存能力和增殖能力｡因此，基于纤维素的自愈水凝胶在药物传递和组织工程的3D细胞培养方面具有潜在的应用价值｡

1. 介绍

一些生物组织，如皮肤､骨骼和肌肉组织，在受到伤害时能够自行愈合，受此启发，自愈合水凝胶近年来发展迅速｡然而，由于缺乏断裂后的键合重整机制，大多数合成水凝胶都没有这种自愈能力｡

迄今为止，通过将动态共价键和非共价键结合到水凝胶网络中来设计和制造自愈合水凝胶为此已经付出了大量的努力｡由于动态共价键，如席夫碱､二硫键､二烯烃-阿尔德反应､苯基硼酸盐配位等，既能整合共价键的稳定性，又能整合非共价键的可逆性，因此它们被用来制备功能多样的自愈水凝胶｡特别是通过Schiff碱基构建的壳聚糖基自愈水凝胶，由于其良好的生物相容性和生理条件下的自动修复能力，已被广泛应用于止血､给药､细胞治疗和3D细胞培养等方面｡然而，这些水凝胶具有相对较快的水解降解速度､较差的结构完整性和较弱的机械性能，阻碍了它们实现更持久功能的生物医学应用｡

酰基腙键是由酰肼与羰基缩合而成的，与席夫碱关系密切，但更稳定｡因此，酰基腙键被用来构建具有强大机械性能的自愈水凝胶｡举例来说，一个强大的自我修复水凝胶结合两种动态共价键:酰腙键和二硫键，展示了自主自愈能力，在两种酸性pH值（3 - 6）和基本（pH=9）条件，但在中性条件下失败，动态酰腙键和二硫键往往是活动“锁定”｡尽管苯胺可以作为促进酰肼基水凝胶在pH值为7的合理时间范围内自愈合的催化剂，但由于苯胺的毒性，该体系在生物医学领域受到显著限制｡因此，开发基于酰基腙键的生物相容性好､强度高､高效的自愈水凝胶用于实际的生物医学应用已成为当务之急｡

纤维素是地球上最丰富的天然多糖，具有无毒､低成本和生物相容性等优点，已被广泛应用于生物医学领域，如给药､创面敷料､组织工程等｡然而，自愈性纤维素基水凝胶却鲜有报道，因为纤维素难以溶解且缺乏形成动态共价键的结合位点（如氨基或羧基）｡幸运的是，在我们的实验室中，纤维素在碱/尿素水溶液中低温溶解，一系列纤维素衍生物在这样的介质中均得到了合成｡这鼓励我们开发来自纤维素的自愈合水凝胶｡

本研究通过动态共价酰基腙键，构建了具有双重响应性和良好机械性能的新型纤维素基自愈水凝胶｡合成了羧乙基纤维素接枝二硫代二丙酸二酰肼（CEC - TPH）和二苯并高聚物聚乙二醇（PEG-DA），并通过肼与醛基的缩合反应生成水凝胶｡介绍了一种具有生物相容性的4-氨基-DL-苯丙氨酸（4a-Phe）作为“绿色”催化剂，加速酰基腙键的交换，使水凝胶具有良好的自愈能力｡水凝胶表现出有趣的pH/氧化还原双响应溶胶-凝胶过渡行为，可用于模型药物的控释｡由于其良好的生物相容性和动态交联网络，水凝胶在L929细胞的三维封装和培养方面也具有很大的优势｡这项研究将为探索更多基于天然多糖的自愈水凝胶在生物医学领域的应用打开一扇新的大门｡

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的原位形成和化学结构

为了设计和构建通过共价酰基腙键的新型纤维素基自愈水凝胶，前体聚合物（CEC-TPH和PEG-DA）由羧乙基纤维素（CEC）和聚乙二醇（PEG）合成，如方案1所示｡首先，通过碳二亚胺偶联反应（Scheme 1a），将二硫代二丙酸二肼（TPH）偶联到CEC的羧基上，制备了水溶性的CEC-TPH｡相比CEC-2的傅里叶变换红外（FTIR）光谱的峰强度在1574 cmminus;1 CEC-TPH分配给羧基组表现出显著的不对称伸缩振动减少（图S2，支持信息），证明许多多糖的羧基组加上TPH energy和转化为酰肼键后修改｡CEC-2､TPH､CEC1 -TPH的1H NMR谱图（图S3，支持信息）显示，来自TPH质子的2.59和2.91 ppm的信号出现在CEC2 -TPH中，说明TPH成功地嫁接到CEC-2链上｡TPH的取代度（DSTPH，定义为每摩尔葡萄糖单位的TPH的摩尔数）由式（1）计算

在AH9′亚甲基质子的积分区域（H9′）的TPH energy段相邻以组为2.71 ppm， （AH8 AH9）的积分区域多重态从2.64到2.20 ppm的亚甲基质子（H9）分配给TPH energy段远离羧乙基组重叠的亚甲基质子（H8）以小组｡结果表明，碳二亚胺与CEC羧基的进料比越大，DSTPH越高｡考虑到CEC-TPH在水中的溶解度和合成水凝胶网络的交联密度，本研究将DATPH控制在0.30｡其次，通过两步法（Scheme 1b）将4-羟基苯甲醛偶联到PEG的末端羟基上，制备PEG- DA｡在PEG和PEG- DA的FTIR谱中（图S2，支持信息），PEG- DA在1720 cm -1处的新吸收带是由于醛基羰基的对称振动引起的｡PEG-甲磺酸 1 h NMR谱和PEG-DA（图S4，支持信息）显示新的质子峰的存在醛为9.87 ppm，芳环在7.80和6.99 ppm，和甲基质子峰的消失在3.08 ppm，暗示与苯甲醛集团挂钩的成功修改｡PEG-DA的醛类官能度通过比较聚乙二醇主链（H5和H5rsquo;）上的亚甲基质子（H4）在4.20 ppm时与乙醚亚甲基质子（H5和H5rsquo;）在3.40-3.90 ppm时的积分面积，证实了聚乙二醇- da的醛类官能度接近100%｡

由于肼和醛基在4a-Phe存在下反应速度快，在温和条件下能迅速形成CEC-TPH/PEG-DA水凝胶，保证了它们的生物相容性和安全性｡如图1a所示，将CEC-TPH溶液与PEG-DA/4a-Phe混合溶液在生理pH和室温下均匀混合，即可制成水凝胶｡根据4a-Phe含量或聚合物总浓度（表S2，支持信息），混合溶液在几秒到几小时的时间尺度内转化为透明的水凝胶｡正如原子力显微镜（AFM）图像（图1b）所示，水凝胶（Gel1）呈现出均匀互联的多孔结构，可以调节质量传输，为细胞生长提供一个舒适的基质，有利于在体内的相同应用｡

这些水凝胶的凝胶化机理是通过CEC-TPH主链上的酰肼基团与PEG-DA末端的醛基之间的缩合反应形成酰腙键（图1c）｡通过FTIR光谱对合成的水凝胶的化学结构进行了确认（图S2，支撑信息）｡在1720 cm - 1处，PEG-DA的醛对称振动（C- O）的吸收峰在冻干凝胶7的光谱中几乎消失，而在1606 cm - 1处，亚胺伸缩振动（C=N）的新峰被观察到，表明在CEC - TPH和PEG-DA之间形成了酰基腙键｡因此，酰基腙作为可逆共价交联剂存在于水凝胶的动态网络中｡我们的研究发现，在4a-Phe的催化作用下，动态酰肼键迅速平衡，不仅有利于水凝胶的形成，而且赋予了水凝胶网络动态､可逆的特性｡如图1d所示，通过可逆酰肼键的快速断裂和重整，纤维素基水凝胶在保持其长期完整性的同时，表现出独特的网络拓扑重排能力｡

2.2 凝胶时间和水凝胶的机械性能

水凝胶的凝胶化时间对其在细胞治疗、药物传递和其他生物医学领域的应用至关重要｡凝胶化时间短不仅会造成细胞或药物的不均匀分散，还会降低水凝胶的可操作性，而凝胶化时间长则会增加细胞和药物从注射部位扩散到周围组织的风险｡为了评价不同4a-Phe含量和总聚合物浓度的CEC-TPH/PEG-DA水凝胶的凝胶化时间，进行了动态时间扫描流变实验来监测凝胶化过程｡如图2a和表S2（支撑信息）所示，聚合物浓度为7.2% wt%的水凝胶在25℃下的凝胶化时间明显减少，从157 min到几秒，4a-Phe含量从0增加到3.15 wt%｡当4a-Phe含量大于1.05 wt%时，在水凝胶形成初期没有观察到储存模量（Grsquo;）和损失模量（G”）的交叉（图2a），说明瞬时凝胶化｡此外，在给定4a-Phe含量（1.05 wt%）下，聚合物总浓度从3.2 wt%增加到7.2 wt%，凝胶化时间从14 min显著减少到2 min（图2b和表S2，支持信息）｡很明显，凝胶化时间很大程度上取决于4a-Phe的含量和聚合物的总浓度，这是因为它们对交联反应速率有显著的影响｡此外，对于固定的4a-Phe含量和聚合物总浓度，温度从25℃升高到37℃，水凝胶的成胶时间略有下降（图2c和表S2，支撑信息）｡因此，通过改变催化剂用量或聚合物总浓度，可以很好地控制水凝胶在生理温度下的凝胶化时间｡理想的凝胶时间对于可注射的生物医学应用是很重要的｡

通过动态扫频流变实验研究了水凝胶的力学性能｡图2d显示了不同聚合物浓度和4a-Phe含量的水凝胶的Grsquo;作为频率的函数｡对于所有的水凝胶，Grsquo;始终高于Grsquo;，并且在整个频率范围内呈现出一个平台，说明水凝胶是稳健的，表现为弹性固体｡当4a-Phe含量固定在1.05 wt%时，随着聚合物浓度从3.2 wt%增加到7.2 wt%， Grsquo;显著增加，从1.51 kPa增加到7.05 kPa，这是由于形成了更密集的交联网络｡然而，Gel4和Gel7的G ＇值没有差异｡这可以解释为，4a-Phe的加入加速了肼与醛的反应速率，而反应的平衡常数变化不大｡这些结果表明，通过改变聚合物的总浓度可以很好地控制水凝胶的机械性能｡细胞外基质的力学性质在细胞的迁移､增殖和分化中起着重要的作用，这一点已被广泛认识｡例如，神经干细胞在较软的材料（弹性模量asymp;0.1-1 kPa）中容易发生神经元分化，在较硬的材料（弹性模量asymp;7-10 kPa）中容易发生胶质分化｡因此，具有可调机械性能的CEC-TPH/PEG-DA水凝胶在神经修复和软骨再生等生物医学领域具有巨大的应用潜力｡

2.3 水凝胶的自愈性能

用直接目视法评价CEC-TPH/PEG-DA水凝胶的自愈能力｡如图3a-c所示，两个凝胶圆盘（Gel8）分别被罗丹明B和亚甲蓝染色并切成两半｡随后，两个不同颜色的半圆形在室温下沿切割线亲密接触6小时，不受任何外部干预｡值得注意的是，它们完全融合成一个完整的水凝胶圆盘，形成的水凝胶足够强大，可以承受垂直于切割面方向的拉力，而不会发生分裂（图3d）｡此外，用光学显微镜记录了两个半圆之间的切口表面的自愈合过程（图3e-g）｡有趣的是，减少两者之间的差距宽37micro;m表面开始出现在（0 h）， 6小时后完全消失｡在治疗过程中，这两个染料分子不断蔓延至整个切割表面，最后彼此相互影响呈现出紫色的边界（图3 c， eg）｡然而，在相同的愈合条件下，没有4a-Phe （Gel4）的水凝胶即使在2 d内也不能自愈（图S5，支持信息）｡这些结果表明，在4a-Phe存在的情况下，水凝胶发生了有效的自愈合｡

为了进一步了解4a- phe在自愈过程中的作用，我们制备了含有更多4a- PHE的圆形水凝胶（Gel9）（图4a），然后研磨成小颗粒（数百微米）｡将水凝胶颗粒填充到心型模具中（图4b），室温下自愈｡与预期一样，这些颗粒在24小时内融合成一个有缺陷的本体水凝胶（图4c），并在36小时内愈合成一个完美的心型水凝胶（图4d）｡然而，相对较少的4a-Phe含量的凝胶（Gel8）即使在几天后也不能完成这个愈合过程｡这些结果表明，水凝胶的自愈性能与4a-Phe含量密切相关｡CEC-TPH/PEG-DA水凝胶的自愈机制可能与水凝胶网络中的酰肼交换反应有关（图1d）｡通常情况下，酰肼在水溶液中的交换反应可以在弱酸性环境下进行（pH = 4.0-6.0），当pH值超出该范围时，反应效率急剧下降｡动态酰基腙键在中性条件下往往被动力学锁住，因此水凝胶的自愈性能显著受损，甚至消失（图S5，辅助信息）｡有报道指出，在pH值为7时，使用苯胺作为亲核催化剂，4a-Phe作为类似苯胺的亲核催化剂，可以显著提高酰基腙的交换速率，也可以加速酰基腙的生成和转胺的平衡动力学｡在我们的研究中，在4a-Phe的催化作用下，水凝胶网络中的酰肼与解离的酰肼和醛类快速平衡｡当水凝胶发生裂纹时，CEC-TPH和PEG-DA大分子会向损伤的界面移动，可逆的酰基腙键会发生改变，水凝胶网络迅速恢复｡

为了定量评价愈合时间和4a-Phe含量对CECTPH/PEG-DA水凝胶愈合效率（HE）的影响，进行了楔形应变压缩试验｡不同4a-Phe含量的原始水凝胶的典型压应力-应变曲线（图S6a，支撑信息）表明，所有原始水凝胶均表现出良好的断裂强度，最高可达50kpa，远高于基于Schiff碱基的水凝胶｡凝胶5和凝胶6的断裂强度和应变与凝胶4非常接近，说明添加4a-Phe对凝胶的力学性能几乎没有影响，这与流变学分析结果一致｡这些结果表明，CEC-TPH/PEG-DA水凝胶具有良好的力学性能｡图4e、f为Gel7在25℃不同时间愈合前后的典型压应力-应变曲线及其对应的HE值｡正如所料，自愈水凝胶（Gel7）的断裂强度随着愈合时间从4小时增加到12小时而增加，最终达到接近于原始强度的值｡此外，在固定的愈合时间和温度（25℃）下，4a-Phe含量的增加可以显著提高自愈水凝胶的断裂强度和HE（图4f和图S6b，支撑信息）｡12 h后，含1.05 wt% 4a-Phe的凝胶（Gel7） HE值高达96.1plusmn;3.0%（图4f）｡此外，还研究了提高愈合温度对水凝胶HE的

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