盐碱胁迫对耐碱豆科牧草五脉山黧豆萌发、生长、光合作用、离子平衡和抗氧化系统的影响外文翻译资料

 2022-08-15 03:08

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盐碱胁迫对耐碱豆科牧草五脉山黧豆萌发、生长、光合作用、离子平衡和抗氧化系统的影响

摘要

比较了盐胁迫（NaCl:Na2SO4 9:1摩尔比，pH 6.44-6.65）和碱胁迫（NaHCO3:Na2CO3 9:1摩尔比，pH 8.71-8.89）对五脉山黧豆种子萌发、生长、光合作用、离子平衡和抗氧化酶活性的影响，阐明了植物对碱胁迫（高PH）的生理适应机制。结果表明，在低胁迫强度下，盐胁迫和碱胁迫对五脉山黧豆种子的影响相似。与盐胁迫相比，高碱胁迫明显抑制萌发、生长、光合作用和根系活力，导致幼苗Na 急剧升高和离子失衡，提高H2O2和丙二醛含量，引起细胞内氧化胁迫。结果表明，在碱性条件下，有机酸的积累是五脉山黧豆维持细胞内离子平衡的中枢适应机制。五脉山黧豆可以促进有机酸的合成，弥补钠离子大量涌入和无机阴离子减少造成的负离子不足。此外，盐胁迫和低碱胁迫对超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性略有提高，但不影响过氧化氢酶（CAT）活性。但强碱胁迫显著提高了SOD和APX的活性，降低了CAT的活性。我们认为，提高SOD和APX的活性可能是五脉山黧豆抗碱性胁迫引起的氧化胁迫的重要机制。

关键词 碱胁迫，离子平衡，五脉山黧豆，氧化胁迫，盐胁迫。

引言

许多报告清楚地表明了碱胁迫的存在（Campbell和Nishio.2000;El-Samad和Shaddad，1996;Hartung等.2002;Kawanabe和Zhu.1991;La·uchli和Luttge.2002;Rao等.2008），这表明碱胁迫比盐胁迫更为严重（Shi和Sheng.2005;Shi和Wang.2005;Yang等.2007.2008a）。在前期研究中，我们建议将盐胁迫定义为由中性盐引起的胁迫，而将碱胁迫定义为由碱性盐引起的胁迫（Shi and Sheng 2005;Shi and Wang 2005;Shi and Yin 1993）。在某些地区，NaHCO3和Na2CO3引起的土壤碱化可能比NaCl和Na2SO4等中性盐引起的土壤盐化更为严重。例如，在中国东北地区，超过70％的土地面积是碱性草原（Kawanabe和Zhu.1991），只有少数耐碱性的盐生植物可以生存（Zheng和Li.1999）。土壤盐分引起的胁迫通常涉及渗透胁迫和离子诱导损伤（Munns 2002）。碱胁迫与盐胁迫的比较表明，高pH会增加碱胁迫的作用。根部周围的高pH环境会导致金属离子和磷沉淀（Shi and Zhao 1997），会极大地影响无机阴离子的吸收，并会破坏组织中的离子平衡和pH稳态（Yang等.2007.2008b）。因此，碱性土壤中的植物必须应付生理干旱和离子毒性，并且还必须保持细胞内离子平衡。

五脉山黧豆是一种天然耐盐的豆科饲料植物，通常分布于中国北部，在韩国、日本和俄罗斯的远东地区。这种植物天然生长在高碱性土壤中，含有高蛋白质。

本研究比较了盐胁迫（NaCl: Na2SO4 9:1摩尔比，pH 6.44-6.65）和碱胁迫（NaHCO3: Na2CO3 9:1摩尔比，PH8.71-8.89）对光合作用、生长、发芽和萌发的影响, 为阐明碱胁迫（高pH）对植物损伤的机理及植物对碱胁迫的生理适应机制，对五脉山黧幼苗抗氧化酶活性和离子平衡进行了研究。

材料和方法

实验1：种子发芽

从中国吉林省西部的碱性草原上采集五脉山黧种子。将两种中性盐以9:1的摩尔比（NaCl:Na2SO4）混合用于盐胁迫。将两种碱性盐以9:1的摩尔比（NaHCO3:Na2CO3）混合并用于碱胁迫。每组使用了五个浓度：50、100、150、200和250 mmolL-1（盐胁迫组标记为GS1-GS5，碱胁迫组标记为GA1- GA5）。盐胁迫和碱胁迫组的pH范围分别为6.40–6.64和8.83–8.98。蒸馏水用作对照。在发芽试验之前，用浓硫酸浸种25min，去离子水洗净每种处理均重复四次，每份含50个种子。将种子放在9cm紧固培养皿中的滤纸上，分别浸入5 mL处理溶液中。将培养皿置于20℃的光照培养箱中，每天暴露于12小时的光线下10天。每天对发芽的种子进行计数，胚根的出现为发芽。每天用蒸馏水补充蒸发的水，以避免盐度变化。将未发芽的种子再转移到蒸馏水中10天，测定其发芽恢复的能力。

实验2：幼苗

植物原料

在直径为17cm的盆中种五脉山黧豆种子，盆中装2.5kg水洗沙粒。每天用Hoagland营养液充分浇水。所有的花盆都放在户外，并避免雨淋。实验期间的温度白天为24-28℃，夜间为20-23℃。

模拟盐和碱性条件的设计

将两种中性盐以9:1的摩尔比（NaCl:Na2SO4）混合用于盐胁迫组。将两种碱性盐以9:1的摩尔比（NaHCO3:Na2CO3）混合用于碱胁迫组。每组分别使用了三种盐浓度：30、60和90mmolL-1。盐胁迫组标记为S1-S3，碱胁迫组标记为A1-A3。因此，在90mmolL-1盐胁迫溶液中，81mmolL-1NaCl和9mmolL-1Na2SO4的混合物产生的离子浓度为99mmol L-1Na ，81mmolL-1Cl-和9mmolL-1SO42-。在用于碱性应力的90mmolL-1溶液中，81mmolL-1NaHCO3和9mmolL-1Na2CO3 的混合物产生的离子浓度为99mmolL-1Na ，81mmolL-1HCO-和9mmolL-1CO32-。盐胁迫组和碱胁迫组，pH分别为6.44-6.65和8.71-8.89。

胁迫处理

当幼苗8周时进行胁迫处理，对幼苗生长有明显的抑制作用。将32盆均匀生长的幼苗随机分为8组，每组4盆。每个罐子被认为是一份。一组用作对照，第二组用于处理初期生长指数的测定，其余六组用于各种胁迫处理。每天17:00-18:00时用含有适量胁迫盐分的营养液彻底浇灌罐子。用营养溶液浇灌对照植株。处理时间为10天。

增长指标的测量

通过便携式光合作用系统（LI6400XT;LiCor，Lincoln,NE,USA）在测定不同位置叶片的确定净光合速率（PN），气孔导度（gs）和叶片的蒸腾速率（E）。相对增长率（RGR）是根据Kingsbury等（1984）确定的。如下：RGR =（lnW2）lnW1）frasl;t2）t1，其中W1和W2是胁迫处理开始和结束时获得的干重，t2-t1是总治疗时间。使用丙酮提取类胡萝卜素（Car）和叶绿素（Chl）a和b，在440、645 和663 nm波长下分光光度法测定每个样品3次。该计算是根据Arnon（1949）的方程式进行的。膜渗透率可以通过电解率（ELR）反映出来，这是使用Lutts等（1996）的修正方法测定的。从每个罐中取鲜叶（1g），去离子水洗3次以去除表面附着的电解质。将叶子放在装有20mL去离子水的封闭比色皿中。将比色皿置于25℃的旋转摇床上4h，用电导率仪DDS-307测定溶液（EC1）的电导率；上海精密科学仪器有限公司，中国上海。然后将试管在120℃高压灭菌20min，并确定溶液的电导率（EC2）。ELR可以定义如下：ELR [％] =（EC1frasl;EC2）times;100。根系的活性按照Comas等（2000）的描述确定。新鲜根置于三苯基氯化四唑（TTC）溶液（0.04％，pH7.0磷酸盐缓冲液中）中37℃60min。根部红色产物是用乙酸乙酯萃取的。用分光光度计测定485nm 处吸光度。根系的活性表现为对照值的100％。为确定组织液的pH，用中性去离子水彻底清洗三遍新鲜的芽，再用滤纸表面干燥。然后将枝条压碎，挤出组织液，用数字pH计PHS-3C测量PH；上海市上海精密科学仪器有限公司。

离子测量

将干燥的植物材料样品（100 mg）在100℃下用20 mL去离子水处理1 h，然后将所得提取液用于测定无机离子和有机酸（OAs）的含量。NO3-，Cl-，SO42-，H2PO4-和草酸的含量由离子色谱测定，使用DX-300离子色谱系统，有AS4A-SC离子交换柱和CDM-II电导率检测器（流动相: Na2CO3 NaHCO31.7-1.8 mmolL-1;狄奥尼斯.桑尼维尔.加州.美国）。利用带有ICE-AS6离子排斥柱的离子色谱系统、CDM-II电导探测器和AMMS-ICE II微膜抑制器（移动相：0.4mmolL-1七氟丁酸;二酮），用离子色谱测定其他原子的水平。用原子吸收分光光度计（TAS-990;普金杰将军.中国北京）测定了Na 、K 、Ca2 、Mg2 和Fe的含量。

脂质过氧化的测定

根据Wolff（1994）测定叶片中的H2O2含量。该测定基于在铁离子指示剂二甲酚橙存在下的亚铁离子氧化。根据Draper和Hadley（1990）的研究，脂质过氧化被测定为丙二醛（MDA）的含量，丙二醛是脂质过氧化的产物。根据Du and Bramlage（1992）的方法测量叶片中MDA含量。简而言之，将含有0.5％2-硫代巴比妥酸的20％三氯乙酸添加到0.2 mL的叶绿体悬浮液中，95℃加热25min，然后在冷水浴中冷却，并在3000 g离心5min。在532nm处测量MDA含量，并通过减去600nm处的吸光度来校正。

抗氧化酶测定

为了测定抗氧化酶活性，在预冷的研钵和研杵中，将0.5 g新鲜叶子在4 mL相应的提取缓冲液中匀浆。将匀浆物通过四层粗棉布过滤，并在4℃下以15,000 g离心20min。在确定抗氧化酶活性之前，将上清液在4℃下再次以15,000 g离心20分钟。根据Bradford（1976）确定可溶性蛋白质含量。抗氧化酶活性以每克蛋白质的单位表示。酶活性数据相对于对照值100％表示。根据Beyer和Fridovich（1987）法，通过测定硝基蓝四唑（NBT）光化学还原的抑制作用来测定超氧化物歧化酶（SOD）的活性。将叶片在1mL冷的100 mmolL-1磷酸钾缓冲液（pH 7.8）中匀浆0.1 mmolL-1乙二胺四乙酸（EDTA），1％（w/v）聚乙烯吡咯烷酮和0.5％（v/v）Triton X-100。SOD活性的一个单位定义为在560nm处监测引起NBT减少50％抑制所需的酶量。为了测定抗坏血酸过氧化物酶（APX），将叶片匀浆置于100mmolL-1的磷酸钠缓冲液（pH7.0）中，加入5mmol抗坏血酸、10%甘油和1mmolL-1EDAT。在1ml反应混合液中加入50mmolL-1的磷酸钾盐缓冲液（pH7.0） ，0.1 mmolL-1的维生素C(消光系数2800L-1mol-1cm-1，0.3 mmolL-1的H2O2，测定APX活性。吸光度在290nm处下降3min （Chen和Asada1989）。通过向反应混合物中添加磷酸盐缓冲液而不是提取物来获得空白。过氧化氢酶（CAT）活性是根据Ferrari等（2009）的方法记录240nm处过氧化氢（H2O2）吸光度的连续降低来确定的。反应在含有25mmolL-1H2O2的3mL磷酸钠缓冲液（50mmolL-1,pH 7.0）中进行。基线吸光度保持恒定，并添加20mu;L上清液以引发催化反应。

统计数据分析

从四次重复获得测量值。使用统计软件SPSS 13.0（SPSS.美国.伊利诺.伊州.芝加哥），通过单因素方差分析对数据进行分析。通过事后最小显着差异检验比较不同处理的平均值。P＜0.05的值被认为是显著的。

结果

发芽

两种胁迫都降低了发芽率，但碱胁迫下的降低幅度远大于盐胁迫（图1A）。将未发芽的种子放入蒸馏水中以恢复发芽，以检查其存活能力。这些种子大多数在盐胁迫和低碱胁迫条件下（30和60 mmolL-1都能恢复发芽，但在高碱胁迫下只有少数种子能够恢复发芽（图1B）。

图1盐和碱胁迫对（A）五脉山黧豆种子发芽率和（B）恢复发芽率的影响。用盐胁迫（NaCl:Na2SO4 9:1;pH 6.44-6.65）和碱胁迫（NaHCO3:Na2CO3 9:1;pH 8.71-8.89）处理五脉山黧豆种子10d，测定种子的发芽率，然后将未发芽的种子转移到蒸馏水中10d，测定种子的恢复率。在每一栏中，相同字母的数据标记在最小显著差异检验中差异不显著（Plt;0.05）。误差条表示四次重复的标准误差（n=4）。

生长

随着盐度的增加，芽中的RGR降低；然而，碱性胁迫RGR下降幅度远大于盐胁迫下降幅度（图2A）。盐胁迫和碱胁迫均增加了植物系统的活性，但强碱胁迫（gt; 30 mmol L-1）导致植物系统活性急剧下降（图2B）。

图2盐碱胁迫对五脉山黧豆根系（A）相对生长速率（RGR）和（B）活力的影响。用盐胁迫（NaCl:Na2SO4 9:1;pH 6.44-6.65）和碱胁迫（NaHCO3:Na2CO3 9:1;pH 8.71-8.89）处理8周龄五脉山黧豆幼苗10d。在每一栏中，用相同字母标识的数据标记以最小显著性差异检验无显著性差异（Plt;0.05）。误差条表示四次重复的标准误差（n=4）。

光合作用

盐胁迫和碱胁迫对净光合速率、光合速率和蒸腾速率的影响相似，在低盐胁迫强度下，三种参数均未受到胁迫的影响，但当胁迫强度大于30mmolL-1时，碱胁迫下的光合速率的减弱程度大于盐胁迫下的光合速率（图3A-C）

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