滇池水华束丝藻毒素对斑马鱼运动能力和大脑乙酰胆碱酯酶活性的改变外文翻译资料

 2022-09-05 05:09

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滇池水华束丝藻毒素对斑马鱼运动能力和大脑乙酰胆碱酯酶活性的改变

摘要

水华束丝藻（A. flos-aquae）是已知的束丝藻素或麻痹性贝类毒素（PSPs）等神经毒素的主要来源，是环境和人类健康的重大威胁。通常，改变神经功能并且体现在行为上。虽然PSPs的作用的分子机制是众所周知的，但是对其在成年斑马鱼神经行为的影响和改变神经功能的关系知之甚少。滇池水华束丝藻毒素通过高效液相色谱法进行分离纯化。在毒素中发现的主要类似物是膝钩藻毒素1和5（GTX1和GTX5；分别为34.04% 和21.28%）和新石房蛤毒素（neoSTX,12.77%）。在斑马鱼（Danio rerio）腹腔注射5.3和7.61mu;g STXeq/kg（分别为低剂量和高剂量）的滇池水华束丝藻毒素。通过观察结合视频的方法观测1到24小时暴露后的6个时间点的游泳活动。两个束丝藻素的剂量都与延迟触摸响应相关，降低头—尾运动能力，头部的转动不灵活，并且重心向尾部转移。正常的S型图案（或波动）的运动轨迹被摆尾后摆动头部的机械运动模式所取代。最后，这些鱼主要分布在水族箱的顶部和/或底部的水中，并在12小时后表现出明显的极化分布格局。神经功能的进一步分析表明，束丝藻素的剂量抑制脑内乙酰胆碱酯酶活性，所有的这些变化呈剂量和时间依赖性。这些结果表明，束丝藻毒素可以通过破坏胆碱能系统改变运动能力、触摸响应和分布格局，并且表明斑马鱼运动行为和乙酰胆碱酯酶可以作为研究自然中束丝藻素和水华的指标。

关键词

束丝藻素、机械变化、运动异常、乙酰胆碱酯酶、大脑、斑马鱼

1.介绍

随着社会的经济发展，营养物质的排出量增加，富营养化和产毒蓝藻水华是主要淡水水体仍然存在的问题（Anderson et al., 2002; Paerl and Huisman, 2008）。令人担忧的是，以束丝藻品种为主的蓝藻水华是麻痹性贝类毒素（PSPs）的密切来源（Jackim and Gentile, 1968; Mahmood and Carmichael, 1986; Pereira et al., 2000, 2004a; Ferreira et al., 2001; Costa et al., 2006; Liu et al., 2006a,b; Ballot et al., 2010; Ledreux et al., 2010）。不过令人鼓舞的是，PSP由于其致命的毒性和广泛的地理分布，备受科学界和公众的关注（Hallegraeff, 2005, 2010）。

近几十年，以滇池束丝藻为主的水华（A. flos-aquae）几乎每年都在中国云南省的滇池发生，因为湖水提供了持续的养分供应、开放发展的良好环境和首选的水温（Xing et al., 2007; Wu et al., 2010）。水华的优势种被证实合成神经毒性PSPs（Liu et al., 2006a,b; Zhang et al., 2011, 2013）。由于滇池这一优势种的流行，滇池束丝藻水华及其分泌的神经毒素PSPs已引起关注，这是人口超过五百万的中国云南省昆明市附近一个重要的淡水来源（Liu et al., 2006a,b; Zhang et al., 2011, 2013）。

PSP，它由甲藻，淡水蓝藻和细菌合成（Kotaki et al., 1985; Kotaki, 1989; Sugawara et al., 1997; Michaud et al., 2002; Prol et al., 2009; Ballot et al., 2010; Hackett et al., 2012），可以积累在水生生物中达到非常高的浓度（Shimizu and Yoshioka, 1981;Sullivan et al., 1983; Llewellyn et al., 2004; Pereira et al., 2004a; Bricelj et al., 2005; Zaccaroni and Scaravelli, 2008），如果人类食用被PSP污染的食品，可能导致麻痹性贝类毒素中毒的发病和死亡（Ferratilde;o-Filho and Kozlowsky-Suzuk, 2011; Faber, 2012; Rodrigues et al., 2012）。然而，PSPs仍没有好的解药，用人工呼吸和液体治疗是目前可用的唯一治疗方法（Wiese et al., 2010）。

至于暴露于PSPs对鱼类的影响，以往的研究表明，PSPs可以从被PSPs污染的枝角类蒙古裸腹溞积累到美国红鱼的幼虫，反过来在实验室条件下通过滤食甲藻亚历山大藻积累毒素。因此PSPs可以从有毒藻类转移到高营养级鱼类（Kwong et al., 2006; Jiang et al., 2007）。当PSPs进入鱼类，它们被证明延缓斑马鱼胚胎的孵化，并且导致畸形和死亡（Oberemm et al., 1999; Lefebvre et al., 2004）。它们也积累在珍珠鲷的肌肉上（Clemente et al., 2010），导致组织病理变化，脂质过氧化（LPO），并抑制鱼的肌肉和大脑的抗氧化活性作用（da Silva et al., 2011b; Clemente et al., 2010）。随着它们的生化和生理的影响，在使用有毒甲藻后，PSPs也影响加拿大底鳉幼虫，冬季比目鱼幼虫和红鲈幼虫，桡足类和猛水蚤的游泳成绩、捕获猎物和回避捕食者（Samson et al., 2008）。这些研究表明，PSPs可能有强力的鱼类毒性作用，不仅诱导生化和生理作用，也造成了仔鱼的行为变化（Ferratilde;o-Filho and Kozlowsky-Suzuk, 2011）。

生物行为的变化经常作为评估点，因为行为改变是毒理学研究中一个重要生物标志物（Cazenave et al., 2008; Ballesteros et al., 2009; Eissa et al., 2010）。通常情况下，内部和外部环境的变化可以引起生物体行为的变化，这往往反映了动物与环境的相互作用（Beacute;gout Anras and Lagardeacute;re, 2004）。事实上，当动物暴露于污染物环境，行为的改变可以作为第一防御反应（Beacute;gout Anras and Lagardeacute;re, 2004）。动物通常会尝试逃脱污染物集中的地方，降低死亡率或增加代谢维持生理平衡发生的机会，从而促进生存、生长和繁殖（Schreck et al., 1997）。然而，有时它的来源是生物体不可能逃避的，他们必须适应面临的情况（van der Oost et al., 2003）。环境的改变会引起生物体内源性的生理、生化和遗传的变化，这些累积的内源性变化可以通过行为途径观测到（Dantzer et al., 2008; Miller, 2009; Macecirc;do et al., 2013）。不像内部改变，行为改变是明显的，可观察到整个有机体的活动，不需要伤害动物就能获得数据（Brewer et al., 1999）。因此行为研究在道德上和濒危物种方面优于其他类型的研究（Festa-Bianchet and Apollonio, 2003; Sutherland, 1998）。因此，行为毒理学也经常作为一种方法被提出来用来监测生态相关的污染物（Scott and Sloman, 2004）。

鱼是水生生态系统中一个重要的不可或缺的一部分，由于其系统位置的脊椎动物在淡水生态系统中处于水生食物链的末端，因而是评估淡水生态系统的压力和影响，以及有害的自然和外源性化学物质的影响的合适实验体（Baganz et al., 1998）。斑马鱼是淡水脊椎动物中的重要模式生物（Brewer et al., 2001）。尽管在过去的三十年里斑马鱼一直是一个热门的研究课题，特别是在发育生物学和遗传学，但是相对于其他模式生物，其大脑功能和行为还没有得到很好的理解，如大老鼠、小白鼠、或果蝇（Sison et al., 2006）。但是最近，斑马鱼在行为科学和神经生物学领域的使用兴趣增加（Sison et al.,2006）。

斑马鱼提供了一个很受欢迎的研究物种，因为它们的体积小，并倾向于成群游动，从而使大量的鱼被安置在小型实验室里（Norton and Bally-Cuif, 2010）。它们的卵子受精和外部发展，一个单一的母体可能每隔一天会产生200-300的后代（Norton and Bally-Cuif, 2010）。虽然这是一个相对简单的脊椎动物物种，但是斑马鱼和包括人类的其他脊椎动物是生理学和解剖学同源的，斑马鱼的大脑也类似于其他脊椎动物的大脑，包括人的大脑（Tropepe and Sive, 2003）。因此，适合于研究脊椎动物的途径和机制，包括人的疾病和临床治疗（Shin and Fishman, 2002; Damodaran et al., 2006; Lieschke and Currie, 2007; Tierney, 2011）。斑马鱼具有典型的脊椎动物神经递质（Mueller et al., 2004; Panula et al., 2006），其神经内分泌系统能为应激反应提供强有力的生理反应（Alsop and Vijayan, 2008）。重要的是，斑马鱼的基因与其他脊椎动物的基因之间的DNA序列的同源性（Barbazuk et al., 2000; Reimers et al., 2004; Lassen et al., 2005），以及脊椎动物大脑解剖的相似性，意味着哺乳动物大脑的复杂的功能特性的机制，可以使用斑马鱼模拟（Gerlai, 2003; Tropepe and Sive, 2003; Kily et al., 2008; Brittijn et al., 2009）。此外，行为分析可以代表研究脑功能的最客观和有意义的方法（Blaser and Gerlai, 2006）。最重要的是，鱼的游泳行为涉及神经系统，改变游泳和运动的活动，从而反映在神经系统的改变（Vogl et al., 1999）。这些因素都对目前的研究有关，因为毒素已被证实为一种神经毒素（Liu et al., 2006a,b）。

到目前为止，斑马鱼作为模式生物行为的研究主要集中在不同化学物质的影响，如农药，次氯酸钠和乙醇，在心理和社会行为上（Baganz et al., 2004; Carvan et al., 2004; Airhart et al., 2007; Nimkerdphol and Nakagaw, 2008; MacPhail et al., 2009; Egan et al., 2009; Irons et al., 2010; Rosemberg et al., 2012）。关于PSPs的行为的研究，只有一些研究调查了斑马鱼幼虫和胚胎以降低感觉运动的缺损，而研究发现，减少太平洋鲱幼虫自发和触摸激活游泳行为，并且增加虹鳟攻击行为（Lefebvre et al., 2004, 2005; Bakke et al., 2010）。这些研究表明，通过滥用毒素或药物可能引起斑马鱼大脑中复杂的行为指令和功能变化，可以在行为层面进行检测。这些结果还表明，使用斑马鱼的行为学研究可以进一步促进遗传学和行为神经科学的发展（Granato et al., 1996; Norton and Bally-Cuif, 2010）。

据我们所知，亚致死剂量水华束丝藻的影响，被证明是神经毒素PSPs，对鱼的运动行为尚未研究。束丝藻毒素诱导斑马鱼运动异常，这反映了在斑马鱼脑胆碱能系统功能的变化尚不清楚。综合评估斑马鱼的运动行为异常和大脑的胆碱能系统功能，因此可能对暴露于束丝藻素的鱼的亚致死反应提供更全面的洞察。因此，在本研究中，束丝藻素从培养的来自于滇池的水华束丝藻分离并且提取和纯化。高效液相色谱分析证实了PSPs的存在，给斑马鱼腹腔注射亚致死剂量的毒素制剂。我们评估运动行为和大脑胆碱能系统功能随之而来的变化，来提供束丝藻神经毒性在斑马鱼大脑的证据，以发展一个滇池水华束丝藻PSP毒性早期预警系统。

2. 材料方法

2.1 化学药品

参考标准的石房蛤毒素（STX）组毒素（dcSTX,STX,neoSTX）和膝钩藻毒素（GTX）组毒素（GTX1-5,dcGTX2和3）由加拿大国家研究委员会，哈利法克斯，NS，加拿大购买。所有其他化学品，除非另有说明，均为从商业来源获得的最高等级。

2.2 滇池水华束丝藻培养

我们收集2002至2006年滇池的束丝藻水华样本（Liu et al., 2006a,b）；取样，分离，鉴定和培养技术的细节在别处提到（Pereira et al., 2000; Liu et al., 2006a; Zhang et al., 2013）。简要地说，藻细胞先在50ml灭菌BG11培养基中培养（25plusmn;2℃，16h：8h光照：黑暗周期，光照强度30mu;mol photon m-2s-1）20天，每天人工搅拌2次，然后稀释到2升灭菌BG11培养基并在相同条件下培养20天产生库存培养物。大型藻类培养物进行稀释储备培养（2L）到4*10L无菌BG11培养基（细胞浓度=~1*104 细胞数/毫升）。培养物在25plusmn;2℃孵化用冷白荧光管连续照明（40mu;mol photon m-2s-1）并且用无菌空气通气充氧。培养物在35-40天后收集，这是产毒最高的相位（Liu et al., 2006b;

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