斑马鱼的肝脏对半致死剂量束丝藻毒素的抗氧化反应研究外文翻译资料

 2022-09-05 05:09

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斑马鱼的肝脏对半致死剂量束丝藻毒素的抗氧化反应研究

摘要：束丝藻水华麻痹性贝类神经毒素（PSPs）被称为束丝藻毒素，其使得全球水富营养化，从而威胁环境和人类健康。尽管麻痹性贝类神经毒素的分子致毒机制已经被广泛研究，但仍有一些问题存在较大争议，尤其是体内肝脏对这种神经毒素的抗氧化反应问题还未解决。本实验中所使用的神经毒素是从滇池水华束丝藻中提取，经过高效液相色谱法分离提纯的，其主要成分是膝沟藻毒素1、膝沟藻毒素5和新石房蛤毒素。通过腹腔注射（5.3和7.61mu;g/STXeq/kgbw作为低剂量和高剂量）对斑马鱼进行毒素处理，在染毒后24小时内的不同时间点，检测斑马鱼肝脏的抗氧化水平。在束丝藻毒素处理1-12h时间内，肝丙二醛（MDA）含量明显增加，表明产生了氧化应激和脂质过氧化。相比之下，在毒素处理3-24h内，斑马鱼体内的还原型谷胱甘肽（GSH）水平显著降低，表明谷胱甘肽参与MDA代谢。而超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性有一个明显的上调，表明束丝藻毒素在斑马鱼体内诱导脂质过氧化，可能造成肝毒性。肝内的MDA、GSH水平和三种酶（SOD、CAT和GPx）可作为研究蓝藻爆发中的PSPs对环境影响的蛋白质生物标记物。

关键词：蓝藻毒素，斑马鱼肝脏，抗氧化反应，生物标记，肝毒性

1、引言

束丝藻毒素是一种在世界性富营养化水体中快速繁殖的有毒丝状蓝藻，能产生海产麻痹性贝类神经毒素（PSPs）。是中国滇池的优势种群，近年来严重影响环境，造成水华。这些水华的产生主要是由于PSPs的分泌，该毒素损伤斑马鱼的形态学和超显微结构，损害其肝脏且对其活动能力有不利影响。滇池湖是昆明城里超过五百万居民的主要淡水资源，用来饮水、灌溉以及支持旅游业，因此，水华对人类的健康和环境安全产生了巨大的威胁。麻痹性贝类神经毒素对当地的经济和其他发展产生了不利影响。

麻痹性贝类神经毒素是一种广泛存在于海洋甲藻、淡水蓝藻甚至是细菌里的生物碱性神经毒素。PSPs在水生有机体里能累积到一个很高的水平，比如以甲藻、蓝藻为食的海贝、贻贝等。然而，处在食物链顶端的人类发病率和死亡率最高。PSPs耐酸碱、耐高温，用普通烹调方法不能完全去除污染该毒素食品中的毒性。目前，仍然没有有效的方法治理PSPs的毒性，同时治疗仅限于人工呼吸和流体治疗。

鱼作为水生食物链的顶端生物，是一种很适合的模式动物，可以用来研究麻痹性贝类神经毒素对鱼的影响。相关研究表明，鱼食用有毒的藻类后，麻痹性贝类神经毒素在鱼体内组织（消化腺等）累积，暗示PSPs能从藻类转移到高一级的鱼体内。据报道，斑马鱼幼体内的PSPs影响了它的生长，导致其畸形甚至死亡，斑马鱼成体内，PSPs在肌肉中累积，斑马鱼肝脏里的凋亡基因表达增加。另外，PSPs还能影响幼体和成体的游泳能力，故PSPs的毒性范围较大，从干扰鱼的代谢和生理功能到诱导鱼的行为异常都有涉及。

在动物食用有毒蓝藻后，肝脏因其重要的代谢功能更加倍受关注。肝氧化应激和抗氧化防御机制经常被认为是毒素处理后的生物标志物，包括化学、生物和物理因素。氧化应激被认为是由活性氧（ROS）的产生和消耗不平衡引起的，而抗氧化系统的低迷导致细胞损伤。活性氧包括超氧阴离子自由基、过氧化物和氢过氧化物。抵御ROS和毒性副产物的主要反应机制包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和谷胱甘肽转移酶（GST），以及非酶系统的抗氧化分子如谷胱甘肽（GSH）。这些组分的水平在鱼组织内的改变通常被认为是在危险情况下体现氧化应激的生物指标，抗氧化水平通常用来反应鱼对不同毒性的生理变化。

当前的工作旨在研究用束丝藻毒素处理斑马鱼后，其肝脏中丙二醛（MDA）的脂质过氧化、抗氧化物酶GSH、SOD、CAT和GPx的变化。束丝藻毒素处理后的反应特性将会使我们更加了解环境毒素对斑马鱼造成的生理和生化变化，阐明毒性机理。此外，观察发现束丝藻毒素可作为研究麻痹性贝类神经毒素和蓝藻水华对环境污染的潜在标志物。

2、材料和方法

2.1、化学药品

所有测量生化参数的试剂盒都购买于南京建成生物工程研究所（中国，南京），PSP毒素的参考标准包括STX毒素组（dcSTX，STX，neoSTX）和膝沟藻毒素组（GTX1-5，dcGTX2，3），购买于加拿大国家研究委员会（哈利法克斯，新斯科舍省，加拿大），其他所有的化学试剂除特别说明外，均为国家标准品。

2.2、毒素制剂

以2002-2006滇池水华期间采集的束丝藻毒素为样品，和之前所说的一样进行隔离藻类养殖，束丝藻在50mlBG11无菌培养基中培养20天（25plusmn;2℃，光循环：暗循环=16h：8h），然后用2L无菌BG11培养基稀释，在相同条件下进一步培养20天。然后用无菌BG11培养基稀释到4times;10L，增加一倍光强度，其他条件不变，继续培养35天，使其最大限度的产生毒素。最后，将其离心后在-20℃冰箱冷冻封存等待进一步分析。

毒素的提取和纯化方法在前人的基础上进一步改进。每克细胞用9体积10mM的乙酸悬浮，冰浴15min，在25℃下不断搅拌30min，然后反复冻融促使毒素浸入培养基中，在光学显微镜下观察到超过99%的细胞裂解时进行离心（5900g，10min，4℃）提取上清溶液。合并各上清溶液后，按体积比9：1加入乙醇，5900g，4℃离心10min，依次用5.0,0.45和0.22mu;m的膜进行过滤，然后用旋转蒸发器进行干燥，之后用10mM乙酸进行悬浮，在使用前用Sep-Pak C18进行过滤。取3ml束丝藻毒素提取液上柱，然后用3ml去离子水洗脱，再用10ml甲醇酸化，收集物用旋转蒸发器浓缩干燥，溶于3ml 10mM乙酸中，保存于-20℃中，用于后续的高效液相色谱分离及毒理学研究。

纯化的毒素提取液用高效液相色谱法来分析，在前人的实验方法上稍作改进，用离子对色谱法和柱后衍生来进行分析。用超过滤器过滤后，取10mu;l进行试验，设置平行组，对于参考标准STXs (dcSTX, STX, neoSTX) and GTXs(GTX1–5, dcGTX2,3)则使用硅基反向柱。将10mu;l样品注射到硅基反向柱中，GTX组毒素的检测和定量使用的流动相是将2mM的庚烷加入到10mM的磷酸铵缓冲液（pH=7.2）中；分析STXs的流动相是将2mM庚烷加入到30mM的磷酸铵缓冲液（pH=7.2）：乙腈（体积比=100：5），流量分别设置为0.8mL/min和1.0mL/min。将7mM的高碘酸加入到10mM磷酸钾缓冲液（pH=9.1）中，连续氧化洗脱液，流量为0.5mL/min，用特制线圈加热到80℃，然后在加入到光检测器之前用0.5mL/min的0.5M乙酸酸化。荧光检测激发波长为330nm，发射波长为390nm。高效液相色谱仪使用岛津LC-20AD液相色谱，流动相、酸化剂和氧化剂在三种不同的位置，数据的采集和处理使用岛津Class-CR10R软件。

STXs和GTXs的提取水平取决于样品和参考标准的色谱图，峰面积和毒素浓度的计算取决于获得的区域和参考标准的已知浓度，样品总体毒性的计算借助于与STX物质的量等价的毒素和它与STX相对毒性的比较，毒素纯化后保存于-20℃。

2.3、毒素剂量的选择

所有动物实验符合动物程序、国际标准和武汉理工大学道德委员会的认可。

斑马鱼毒素剂量在前人研究的基础上作了一些修改。开始时先用无菌微量注射器将低剂量的束丝藻毒素（5mu;l，6.4mu;g STXeq/kg，用30mu;l 10mM乙酸稀释）通过腹腔注射注射到斑马鱼体内，如果该鱼在24h内死亡则用更低的剂量进行检测，如果24h内未死亡则将动物暴露于更高剂量的毒素中。这个过程一直持续进行直到找出导致0%和100%死亡率的最大剂量和最小剂量。最后找到两种剂量分别为：5.3和7.61mu;g STXeq/kg，分别表示低剂量和高剂量。低剂量毒素产生明显的行为毒性但不导致死亡，高剂量毒素造成行为毒性而且有30%的死亡率，通过10mM乙酸可以控制动物的接收效率。

2.4、肝脏样品的制备

本次实验中取同一批受精的105条健康的雄性斑马鱼同时培养。鱼均养了110天，重量在0.4plusmn;0.01g，长度均在3.27plusmn;0.2cm。斑马鱼饲养在矩形玻璃容器中，温度维持在28plusmn;1℃，每天保持14h光照。每天用晒干虫卵喂养两次，尽量减少其他因素对实验的干预。

驯化10天后，将105条鱼随机均分成三组（对照组、低剂量组、高剂量组），低剂量组和高剂量组分别通过腹腔注射注射30mu;l用10mM乙酸配制的5.3和7.61mu;g STXeq/kg的束丝藻毒素，对照组则只注射30mu;l 10mM的乙酸，注射后不再进行喂食。

三个组在毒素暴露后0，1，3，6，9，12，和24h的每个时间点均取5条鱼进行冷敷（-8℃下冰颗粒），取出肝脏，用0.86%的生理盐水清洗三次，在液氮中快速冷冻后保存在-40℃环境中以便进一步分析。

每个时间点取出大约30mg冷冻肝脏，加入0.86%的生理盐水，电动匀浆30s每次，直到显微镜下观察得到99%的细胞裂解破碎。5900g冷冻离心10min取上清，得到肝提取液，包含氧化参数（MDA）、抗氧化酶（SOD、CAT和GPx）、非抗氧化酶（GSH）和蛋白混合物。蛋白浓度的定量测定采用考马斯亮蓝G-250法，以牛血清白蛋白作为参考标准。

2.5、生理参数的检测

生理参数的测定方法均按照南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。

MDA的测定采用发光底物法，制备100mu;l新鲜的10%肝脏提取液，与4ml硫代巴比妥酸混合后，放于95℃水浴锅中孵育40min，生成红色的化合物。反应后用自来水冷却，1500g离心10min，利用96孔板和酶标仪测定A532nm，以没有肝脏提取物的溶液为参比，平行测定。

GSH含量的测定是通过将30mu;l新鲜的10%肝脏提取液与1.53ml现制备的谷胱甘肽反应液混合均匀后孵育5min，生成黄色混合物，利用96孔板和酶标仪测定A412nm。

SOD活性测定是先将50mu;l新鲜的10%肝脏提取液与1.3ml现制备的SOD反应液混合均匀后37℃孵育40min。加入2ml显色剂，混合孵育10min，产生紫色产物，测定A550nm。

CAT活性测定是先将50mu;l新鲜的10%肝脏提取液与1.1ml现制备的CAT反应液混合均匀，37℃孵育1min，然后加入1.1ml显色剂孵育10min，生成黄色产物，测定A405nm。

GPx活性测定是将200mu;l新鲜的肝脏提取液与2.3ml现制备的GPx反应液混合均匀后37℃孵育20min，然后加入2.3ml的显色剂反应10min，生成黄色产物，测定A412nm。

MDA含量的单位为nmol TBA/mg蛋白/h，SOD酶活力单位为U/mg蛋白，CAT酶活力单位为U/mg蛋白，1酶活力单位的GPx表示每分钟每毫克蛋白减少1mu;mol的GSH，GSH含量的减少用mu;gGSH/mg蛋白表示。所有测定均平行测定三组。

2.6、数据分析

所有数据均采用SPSS 13.0分析，所有数据均基于三组平行实验，组间显著差异采用单因素方差分析，比较值P＜0.05则认为差异显著的，P＜0.01则认为差异较显著，而P＜0.001则认为差异十分显著。

3、结果

3.1、毒性分析

高效液相色谱分析发现从束丝藻中提取的毒素含有三种毒性成分：STX，GTX1和GTX5，按照各自的对照标准有相同的迁移率。滇池水华中的麻痹性贝类神经毒素的浓度为9.52ng/mg干重。高效液相色谱法证实提取的毒素纯度为69.57%，GTX1占主要成分，含量为34.04%，GTX5和STX分别占21.28%和12.77%。研究表明注射30mu;l 10mM的乙酸没有任何参数影响。

3.2、MDA含量

实验组中斑马鱼肝脏的MDA含量显著高于对照组（P＜0.05）。在暴露后的1至12小时之间，高剂量组和低剂量组的MDA含量显著增加，在3至6小时增加格外明显，MDA平均含量高于对照组2.05倍和1.31倍。MDA含量的最显著增加分别发生在高剂量组的6小时和低剂量组的3小时，分别高于对照组2.3倍和1.72倍。另外高剂量组在12至24小时和低剂量组在9至24小时的MDA含量均有少量回升。

3.3、GSH含量

毒素处理后的斑马鱼在3-24小时，肝脏内的GSH显著降低（P＜0.05），高剂量组和低剂量组的平均GSH含量高出对照组43.94%和33.8%，尽管在暴露后的短时间内高剂量组和低剂量组的GSH含量有短暂增加，达到控制组的120%和118%。高剂量组和低剂量组的最低GSH水平出现在24小时后，分别只有对照组的49.21%和42.1%，且在毒素处理24小时后，GSH含量的降低没有得到恢复。

3.4、SOD活性

毒素处理后的实验组SOD活性相对于对照组明显增加（P＜0.05）。高剂量组和低剂量组在暴露1至9小时后，平均活性增加到2.23倍和1.77倍，在暴露12小时后，活性

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