纳米基因枪：一种新型的纳米级弹体材料用于基因枪中转染细胞和组织的方法外文翻译资料

 2022-11-04 04:11

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纳米基因枪：一种新型的纳米级弹体材料用于基因枪中转染细胞和组织的方法

摘要

背景介绍：基因枪转染法已经被证明是日益受欢迎的方法来包裹DNA 或RNA进入那些用传统基因转染方法难以进入的细胞。该技术常规使用直径为1mu;m左右的“微粒”，用加压气体将其轰击进入到组织中。这些微粒将DNA递送到细胞中是有效的，但是不能有效地转染小细胞并且可能导致显着的组织损伤，从而限制其潜在的有用性。在这里，我们研究了在基因枪转染中使用40 nm直径的射弹“纳米粒子”，以确定它们是否适合替代微粒。

结果：在一定的条件范围内：不同浓度的DNA和不同的准备顺序，检测基因枪转染HEK293的效率结果显示，微粒和纳米粒有相似的性能。然而，使用纳米颗粒导致转染后HEK293细胞损伤减少约30％。小鼠耳朵组织的基因枪转染实验显示了两种类型的颗粒的相似的深度穿透，并且还显示在纳米颗粒转染的样品中lt;10％的细胞核被损坏，而在微粒转染的样品中gt; 20％的细胞核被损坏。当使用纳米颗粒时，细胞结构细节的可视化也显着增强。

结论：我们得出结论：纳米颗粒与微粒一样有效的用于基因枪转染，并且更加适用于小细胞转染，尤其是当细胞结构和／或组织损伤成为问题的时候。

背景介绍

基因弹道技术可以运送外源DNA进入其他转染方法所不能进入的宿主细胞，是十分有用的基因转染技术，并且很有潜力运送其他的生物大分子进入细胞，比如RNA。这项技术原先广泛应用于植物转染，但是，由于这是一种物理方法而非化学转染过程，它的使用并不会受细胞类型的限制。比如，它已经广泛应用于转染神经元(有些是众所周知难转染的)、组织深层的细胞（DNA可以穿过其他细胞被运送相当远的距离。比如全层皮肤）还有细菌。目前，它在核酸调控免疫领域的应用引起人们的兴趣。1990年代，研究表明DNA免疫可以调控保护免疫系统，例如质粒DNA包裹进入细胞引起特定的抗原抗体反应。

多种用于基因枪转染技术的系统已经被开发出来，其中Helios基因枪（Bio-Rad公司）是目前最为广泛使用的一种。这种基因枪通过范围相对宽的表面运送颗粒，已经被证明能有效应用于培养的细胞或薄层组织区域，而且经过改进的弹道可以更深层次、更精确的递送外源基因。然而，使用任意一种基因枪弹道，都会造成组织损伤。比如，射击中心培养细胞的损失或组织中出现大量受损细胞。这是基因枪在人和动物治疗中有相当大的潜力的同时，所面临的问题。也是转染精细细胞制剂所面临的问题。有一种可行性的方法去降低组织损伤是缩小携带外源DNA的粒径尺寸。目前大部分方法都是用微米级别的颗粒，通常是1um左右的颗粒，但是小粒径（100-800nm）颗粒成功的使用已经有一些报道。使用较小颗粒具有允许更有效转染进入较小细胞和特定细胞区域的潜在优点。例如，我们课题组有人一直在研究运用基因枪技术检测树突状脊椎的结构（用小颗粒将染料插入细胞）。这些脊椎的长度在0.5-3um，需要用到纳米级别的颗粒，这些颗粒也已经可以很容易获得。然而，目前还不清楚这种颗粒是否合适将外源DNA运送到细胞中。所以，本文已经研究了，同1um的颗粒相比较，40nm颗粒的运送效率、深度穿透、组织损伤情况。

实验方法：

微米和纳米颗粒

对于40nm（Alfa Aesar,MA,USA）和1um(Bio-Rad实验室，USA)颗粒，颗粒的核心直径分别是40 plusmn; 0.8 nm或 991 plusmn; 11 nm。 这些颗粒的流体动力学直径分别为47.2plusmn;1.3和1060.7plusmn;2.4nm，由光散射决定。 它们的电学性质相似（分别为54mV和55mV）。 为了确认尺寸，我们还使用电子显微镜检查了颗粒（图1）。

弹丸准备

我们将弹丸定义为通过亚精胺和钙离子将DNA沉淀到金颗粒上的颗粒。电镜图像显示被包裹上DNA的颗粒和没有包被的颗粒大小相近，如40nm和1um。颗粒按照之前文献的方法准备，分别用到1um或40nm直径的金颗粒。简言之，将50mu;l0.05M亚精胺和10mu;lDNA（浓度分别是0.5、1、2或4mg / ml的pEYFP-N1质粒）加入到10mg颗粒中（DNA /子弹的最终量为0.25、0.5、1或2mu;g）。通过涡旋激活混合物，同时在10-15mu;l每滴条件下加入50mu;l 1M CaCl2。在间歇混合5分钟后，通过离心（1,000times;g，30秒）除去上清液，并将金沉淀物重新悬浮于3.5ml 0.075M聚乙烯基吡咯烷酮（PVP; Sigma）中。然后将该悬浮液插入Tefzel管（0.1mm内径; Bio-Rad）中，使金沉淀，并除去上清液。然后旋转管道以确保金分子的均匀分布，随后用氮气干燥。使用管切割器（Bio-Rad）将管切割成1cm长度以产生子弹，其立即使用或在4℃下用干燥剂储存直至需要。

基因枪转染

人体胚胎肾脏细胞HEK293型细胞在DMEM/F12培养基、7% CO2 培养箱中培养。它们在35mm板上直径为22mm的玻璃盖玻片上生长直到60-80％贴壁的情况下做转染实验。 他们用装有涂覆的射弹的修改的基因枪，在距离1cm的50psi的气体压力下进行细胞转染。 24小时后，用4％多聚甲醛（PFA; Sigma-Aldrich）固定，用二脒基-2-苯基吲哚（DAPI; Vector）复染，并使用Vectashield（Vector）装载。用改进的基因枪，在75psi的气体压力条件下，在5mm的距离处射击成年小鼠耳朵组织（取自死亡小鼠中）。首先用4%PFA固定，应用切片机制作50mm的切片。将切片用DAPI复染5分钟。 如先前所述的方法，同样制备脑切片，并使用50psi的气体压力和10mm的距离用修饰的基因枪转染。 24小时后，用DAPI复染5分钟。 在转染前后没有观察到明显的颗粒聚集。所有图像均使用Bio-Rad Radiance Plus共焦显微镜观察所有图像。 数据以平均值plusmn;SEM表示。

结果

评估纳米颗粒的效率

通过在n个单独的转染实验中检查，用gt; 1000个细胞中的黄色荧光蛋白（YFP）的表达来检测转染效率（如图2所示）。 使用1mu;gDNA涂覆的1mu;m微粒（每次射击）显示27plusmn;4％的效率（n = 12）; 在相同条件下使用40nm纳米颗粒的转染显示类似的效率（25plusmn;4％，n = 12）。 对于两个样品，我们观察到0.5mu;gDNA的转染效率较低（微米和纳米颗粒的转染率平均值分别为8.8plusmn;2.7％和7.8plusmn;2.1％，n=6）和2mu;gDNA（14.5plusmn;3.6％和12.9plusmn;3.8％，n = 6），在0.25mu;g（n = 6）处没有可观察到的荧光，表明转染的最佳值为1mu;g，如以前使用微粒的研究所示，例如 。 当用1mu;gDNA制备的1mu;m或40 nm射弹直接加入细胞培养基（n = 3;gt; 1000细胞检测）时，不发生转染。

组织损伤

基因枪技术遇到的一个特殊问题是细胞/组织损伤。在培养细胞中，这种转染导致射击周围区域细胞死亡。这个区域死亡的细胞同被用来输送微弹的氦气吹走的细胞相比有明显差别;对于1mu;m和40nm的微粒，相似数量的细胞被气体爆炸所吞噬。为了量化细胞损伤，我们计算了转染后24小时使用DAPI染色（其标记细胞核并显示出具有死亡或受损细胞的增强的荧光）定义的死亡或受损细胞的程度。这些数据显示，对于1mu;m颗粒的射线中心为63.7plusmn;3.5mu;m，对于40nm的粒子为21.7plusmn;1.3mu;m，（n=6,p lt;0.05）。因此，使用纳米颗粒导致相当少的细胞损伤。为了进一步探索损伤的问题，我们从6个小鼠耳朵样品中检测了100个随机选择的细胞，并用DAPI检测了其生存力。数据显示，9 plusmn; 2% 细胞在纳米颗粒转染的过程中死亡，有22 plusmn; 3% 组织细胞在微米颗粒的转染过程中死亡。（有明显差异，n=6,plt;0.05）。因此再次使用纳米颗粒显着降低细胞损伤。 用1mu;gYFP-DNA涂覆的1mu;m或40 nm射弹的耳朵样品的生物学转染支持这些结论：10个随机选择的图像的检查显示，于后者相比前者中较少的细胞YFP标记（图3）。

亚精胺和氯化钙的影响

为了确定DNA对不同弹丸的粘附性是否存在差异，我们研究了去除两种试剂亚精胺和氯化钙对转染效率的影响（图4）。 对于1mu;m和40nm颗粒，亚精胺不存在将转染效率降低至6.1plusmn;2.2和4.6plusmn;1.7％（没有显着差异，pgt; 0.05，n = 6）。 氯化钙的缺乏在两种类型的微粒中的效率相似，虽然有较小的有害作用（分别为17.2plusmn;3.2和16.6plusmn;2.5％;没有显着差异，pgt; 0.05，n = 6）。 当从制剂中除去亚精胺和氯化钙时，或者当使用未处理的乳剂时，没有显着的转染（数据未显示）。 这些数据表明DNA对两种不同大小的射弹的粘附特性是相似的。

深度渗透

在许多实验和治疗应用中，将外源基因深入到活体组织中是有利的。 探讨纳米颗粒是否与微粒一样有效，我们应用基因枪转染老鼠耳朵组织，然后检测组织来确定颗粒的定位。这些研究表明，与纳米颗粒相比，微粒的最大深度穿透率没有显着差异：记录的最大深度分别为50plusmn;11mu;m和31plusmn;6mu;m的微米颗粒和纳米粒子（n = 6，没有显着差异，p gt; 0.05）。 我们之前已经使用深度穿透琼脂块来比较修改的与传统的基因枪管的效果。琼脂块比皮肤柔软。并且使用微粒，数据揭示，相对于原始枪管的最大深度穿透度100mu;m，改良的基因枪管最大深度穿透度为500nm左右。 表明穿透皮肤比通过我们以前使用的琼脂块要低10倍。因此，由于基因枪潜在应用于基因治疗，通过皮肤的深度比较更能有效的评估穿透深度这个特点。

检测小细胞的结构

小粒径的颗粒能使外源基因转染进入细胞，而大粒径的颗粒不能有效的携带外源基因进入细胞。 如图五，使用40 nm或1mu;m颗粒的脑切片的基因枪转染实验显示出YFP标记的Pur-kinje细胞。当使用40 nm颗粒时，小的细胞结构（如树突棘）的分辨率大大提高。

讨论

我们在这里研究使用纳米级粒子使用于基因枪方法转染入细胞和组织样品中。 制备这些纳米颗粒的方法与用于制备微粒的方法相同。我们的数据显示，纳米颗粒的效率与微粒的效率相似，它们的使用导致较少的组织损伤。使用脂质，聚合物或电穿孔的转染技术，培养细胞中转染的效率可能要高得多，在HEK 293细胞中我们观察到水平gt; 80％（数据未显示）。然而，基因枪的特殊优点是其能转染不能通过上述其他转染方法的细胞，以及用于在组织中转染细胞。目前对使用基因枪将DNA疫苗递送到皮肤和肌肉以及基因治疗中的研究兴趣很大。例如，在小鼠Duchenne抗肌萎缩蛋白模型中引入抗肌萎缩蛋白cDNA，用微粒弹体打枪，在打枪的60天后仍可以检测到抗肌萎缩蛋白。因此，发现较小的射弹同样有效但是导致较少的组织损伤，因此可以对作为治疗技术的基因枪的可行性产生重大影响。还可以修饰纳米颗粒，例如，与聚乙烯亚胺产生阳离子金颗粒，已经显示出递送量增加的DNA，尽管这些颗粒的效率和损害倾向尚未得到检验。使用这种小颗粒作为遗传物质的有效载体也增强了有效转染较小生物体或细胞特定区域如树突棘的前景。

结论

纳米颗粒具有与微粒相似的生物转染效率，可用于有效转染小细胞，细胞器或特定细胞区域。此外，它们较小的尺寸导致较少的组织损伤，表明它们更适用于那些易存在组织损伤问题的组织中。

图片分析

图1纳米颗粒和微粒。 微粒的电子显微镜图像（左侧面板;比例尺=1mu;m）和纳米颗粒（右侧面板;比例尺= 40nm），以显示它们的比较尺寸。 这些图像中的颗粒用DNA包被，分别具有40和991nm的流体动力学直径。

图2纳米和微粒在转染HEK 293细胞时显示出类似的效力。 A和B细胞用含有0.5,1或2mu;g编码黄色荧光蛋白（YFP）的DNA沉淀在金射弹上的单次“射击”转染。 将细胞孵育24小时，固定，然后使用共焦显微镜检查。 详情请见文字。 图像代表从至少6个转染的gt; 1000个细胞。 用未涂覆的金颗粒或具有0.25mu;gDNA的细胞转染的细胞不表达（数据未显示）。 YFP =黄色荧光蛋白; DAPI =显示细胞核的二脒基苯基吲哚; MERGE =组合图像。 刻度棒=15mu;m。 C.使用1微米或40纳米金射弹，用1mu;gYFP-DNA生物地转染的HEK293细胞的典型低分辨率图像。 刻度棒=100mu;m。

图3耳细胞。 使用1mu;m或40 nm金色射弹，用1mu;gYFP-DNA进行生物样本转染的耳细胞的典型图像。 这些图像来自20cm深度的组织部分。 刻度棒=10mu;m。 gt; 10个图像的检查显示在微粒转染的细胞中〜10％的YFP标记细胞减少，与我们的数据显示在这些样品中更多的组织损伤

图4在不同条件下使用微纳米颗粒的HEK293细胞中生物素转染效率的比较。使用亚精胺和CaCl2将编码YFP的DNA常规沉淀在金射弹上。通过在用1mu;gDNA包被的金颗粒转染24小时后通过共聚焦显微镜记录的荧光HEK 293细胞的数量测量，去除这些组分之一导致蛋白质表达的显着损失。在没有亚精胺的情况下，1mu;m和40 nm金颗粒的转染效率分别降低到6.1plusmn;2.2和4.6plusmn;1.7（n = 12;显着不同，Student t检验，p lt;0.05），在没有只有CaCl2转染效率分别降低到17.2plusmn;3.2和16.6plusmn;2.5（n = 12;显着不同，学生t检验，p lt;0.05）。用不含DNA或不含亚精胺和CaCl 2制备的放射体转染的细胞不产生荧光细胞（数据未显示，n = 12）。

图5转染微纳米颗粒后浦肯野细胞标记的比较。

图像显示，当与用1毫米射弹（B）转染的那些相比，用40纳米射弹（A）对脑切片进行生物学转染时，可见更大的结构细节。

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