成熟拟南芥在琼脂培养基注入聚乙二醇的干旱模型中对水势降低的早期反应外文翻译资料

 2022-11-08 08:11

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成熟拟南芥在琼脂培养基注入聚乙二醇的干旱模型中对水势降低的早期反应

作者：

Andrej Frolov Tatiana Bilova Gagan Paudel Robert Berger Gerd Ulrich Balcke Claudia Birkemeyer Ludger A. Wessjohann

总结：

干旱是世界上导致植物产量损失增加的一个重要环境压迫源。因此，迫切需要发展新的增加农作物抗逆性的方法。这需要对干旱胁迫进行精确和充分的建模。由于这种类型的应力表现为基底水势的稳定下降（psi;w），注入聚乙二醇（PEG）的琼脂板是完美的实验工具：它们易于制备并提供不断降低的psi;w，这在土壤模型中是不可能的。然而，目前这种模式仅适用于幼苗，不能用于成熟植物的胁迫反应评估，这显然是干旱耐受性研究中最适合的对象。为了克服这个限制，我们介绍一种适用于6-8周龄拟南芥植物的基于PEG的琼脂灌注模型，我们首先了解成熟植物在PEG输注琼脂上生长的早期干旱胁迫反应。我们描述初级代谢物（糖和相关化合物，氨基酸和多胺）伴随着蛋白质的定性和定量的变化而发生的基本的改变：在干旱胁迫条件下注释了多达87种独特的应激相关蛋白，而另外84种蛋白质显示出变化丰富。获得的蛋白质组图谱与针对幼苗和土壤模型报告的蛋白质组图略有差异。

缩略词

ABA

脱落酸

ASC

抗坏血酸

BHT

丁基羟基甲苯

CID

碰撞诱导解离反应

DDA

依赖于数据的采集

DHA

脱氢抗坏血酸

DTT

二硫苏糖醇

ESI

电喷雾电离

FOX

亚铁离子氧化-二甲酚橙

GC

气相色谱法

GSH

还原型谷胱甘肽

GSSG

氧化型谷胱甘肽

ID

内部直径

LC

液相色谱法

Lea

晚期胚胎丰富

lipooh

脂过氧化氢

Lit

线性离子阱

MES

2 -（N-吗啉）乙磺酸

MS

质谱

MS/MS

串联质谱

PARG

聚（ADP-核糖）水解酶

PARP

聚（ADP-核糖）聚合酶

PCR

聚合酶链反应

PEG

聚乙二醇

PS

光系统

Q

四极

ROS

活性氧

RT

室温

TCA

三羧酸循环

TFA

三氟乙酸

TCEP

三（2—羧乙基）膦盐酸盐

Rubisco

核酮糖二磷酸羧化/加氧酶

SDS-PAGE

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

TMS

三甲基硅基

UPLC

超高效液相色谱法

UV

紫外线

关键词：琼脂灌注模型；拟南芥；早期干旱反应；实验性干旱胁迫；代谢组学；蛋白质组学

介绍：

非生物胁迫是造成全球农作物产量损失的主要原因（rodziewicz et al.，2014）。干旱是在植物中的非生物胁迫的重要表现（克鲁兹de卡瓦略，2008），并且可以定义为低于平均降水量的时期，它限制了在自然或农业系统下的植物生产力（Boyer，1982）。其他几个非生物环境因素，如高盐度和降低或升高的温度，也导致水供应减少（即缺水），因此，导致干旱胁迫的发作（verslues et al.，2006）。博耶认为，这种缺水可以被表示为水势降低（psi;W），即溶液和纯水的水势之间的电位差除以水的偏摩尔体积。

独立于水势psi;W降低的环境触发因素的开始，干旱胁迫的结果是气孔关闭，抑制CO2同化，积累细胞内降低的对应物，细胞质体和线粒体电子传递链超负荷，和过度生成活性氧（ROS）：超氧阴离子自由基（O2-），过氧化氢（H2O2），单线态氧（1O2），一氧化氮（NO）、羟基自由基（OHbull;）（KAR，2011）。生成的ROS很容易参与自由基介导的单糖氧化（Wolff et al.，1987）和脂质过氧化的过程（Halliwell et al.。，1993），导致细胞内浓度急剧增加。最后，活性氧产生量超过了细胞的抗氧化能力，氧化应激得以发展（KAR，2011）。在这些条件下，脂质、蛋白质和核酸的氧化增强导致基础生化功能--基因表达、酶活性、转运效率和细胞完整性等的剧烈变化（Gill et al，2010）。此外，剧烈的脱水改变了植物细胞内和分子间的相互作用（prestrelski et al.，1993）。因此，干旱胁迫最终导致植物生长不易甚至死亡干旱（Gill等人，2010）

在这样的背景下，植物对低水势psi;W的反应被直接用来减轻这些负面影响。可以通过避免压力或胁迫耐受机制来使植物更好地生存。而这些机制需要植物蛋白组学和代谢组学基本的变化（Levitt，2015；verslues et al，2006）。第一个策略采用了代谢调节，以提高机体的抗氧化能力（Szarka et al，2012），并且通过减少组织水势psi;W防止脱水（Dichio et al，2006）。这种渗透调节是由低分子量的溶质（氨基酸、多胺、多元醇和糖）的积累来实现的。这些低分子溶质称为渗透调节物质，它们不影响植物的代谢，甚至在高浓度下也无影响（Yancey et al.，1982），也可以作为ROS相关自由基清除剂（Krasensky et al.，2012）。耐受机制依赖于保护蛋白-参与ROS解毒作用（如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶）（Gill et al，2010），胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）（例如，脱水蛋白）作为膜保护蛋白，伴侣蛋白结构（Bhargava et al.，2013），或DNA的保护，例如，PARP / PARG系统等过程的酶（De et al,2005; Geissler et al, 2011）。

当然，为了发展新的策略以提高植物抗旱性，需要有关于植物蛋白组学和代谢组学对干旱相关的变化的相关知识。为了获得相关知识，我们需要有充足的干旱胁迫模型。在此背景下，使用PEG琼脂培养基为创建胁迫（van der Weele等人，2000）提供了最佳的实验方法：它提供了一个稳定的、定义明确的基质水势psi;W，同时避免了PEG与根表皮的潜在的有害的直接接触（如PEG含水培养物）。因此，伴随干旱发生的事件可以被充分建模，其结果的解释也是直接简单的（verslues et al.，2006）。然而，这个设置有一个内在的限制：它只适用于幼苗而不适用于成熟的植物，除非将成熟植物在液体培养基浮萍系统培养（Geissler et al，2011）。然而，关于成熟植物的干旱应答的相关知识是保证农业适宜、成功的主要因素。为了克服这个限制，目前，我们在此利用PEG琼脂灌注模型用于成熟拟南芥植物，并首次描述拟南芥在这个模型中的早期干旱应答。

材料和方法：

试剂

除非另有说明，材料均从以下制造商获得：AATBioquestreg;，Inc（Sannyvale，USA）：Amplite Fluorimetric Glutathione GSH / GSSG Ratio Assay Kit; AppliChem GmbH（德国达姆施塔特）：三（羟甲基）氨基甲烷（超纯）；Biosolve（Valkenswaard，NL）：乙腈（MS级）；Carl Roth GmbH＆Co KG（Karlsruhe，Germany）：琼脂，聚乙二醇（PEG）8000（p.a.），2-N吗啉代磺酸酸，MES（p.a.）、十二烷基硫酸钠（ge;99.5%）,三-（2 -乙基）膦盐酸盐（TCEP，ge;98%）和甘油（ge;99.5%）；Conlac GmbH（莱比锡，德国）：正己烷（puriss）；Dichrom GmbH（Marl，德国）：progentatrade;阴离子酸不稳定的表面活性剂的AALS II；Macherey-Nagel GmbH amp; Co KG (Duuml;ren, Germany)：N-甲基-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MS级），chromabondreg;xr-xc吸附剂，chromabondreg;多96微孔板20micro;m过滤器；圣克鲁斯生物技术有限公司（海德堡，德国）：D6脱落酸（纯）；SERVA Electrophoresis GmbH （海德堡，德国）：丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（37.5/1，30%（w/v），2.6%C）、过硫酸铵（p.a.）、N，N，N，N-四甲基乙烷-1,2-二胺（研究级），考马斯亮蓝G 250（纯）、甘氨酸（p.a.）、蔗糖（gt; 98%），来自猪胰腺的NB测序级修饰胰蛋白酶和蛋白酶抑制剂混合物M；VWR International GmbH(Dresden, Germany)：乙腈（ge;99.9%）。所有其他的化学品均购自SigmaAldrich Chemie GmbH(Taufkirchen, Germany)。 PureLab超分析系统（ELGA Lab Water，Celle，Germany）内部纯化水（电阻gt;18mOmega;/ cm;总有机含量lt;1ppb）。

植物栽培与胁迫应用

野生型拟南芥种子（哥伦比亚）是从室内生长的植物中获得的并且进行消毒处理。在干燥低温（4°C）条件下对种子进行积层处理两天。在无菌条件下在配备有96孔聚丙烯托盘的培养箱内进行发芽和植物生长，加入200毫升1/2MS培养基中并添加0.5%（w/v）蔗糖，pH值为5.7（培养基水平覆盖托盘的下表面）。200micro;l-聚丙烯管填满含有0.8%（W/V）琼脂的1/2MS 培养基（图s-1a）。当琼脂凝固后

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