砷、铜和草甘膦对秀丽线虫行为、繁殖以及热激蛋白应答的联合毒性外文翻译资料

 2022-12-30 11:12

砷、铜和草甘膦对秀丽线虫行为、繁殖以及热激蛋白应答的联合毒性

原文作者：

Yunbiao Wang1 · Anastasia N. Ezemaduka1 · Zhuheng Li2 · Zhanyan Chen1 · Chuantao Song3

摘要：土壤秀丽线虫在砷、铜和草甘膦以及砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物的24小时的急性处理下，研究其混合物对线虫的影响。观察到砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物的急性毒性之间具有协同作用。分别对砷、铜和草甘膦以及砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物分别进行了24小时的1 / 1000 LC50、1 / 100 LC50和1/10 LC50浓度下半致死实验以观察机体行为的响应（头部抽动）、繁殖情况和热休克蛋白表达变化。头部抽动频率和繁殖在单一或联合实验用的化学应激源处理下浓度依赖性均降低，甚至在微摩尔浓度下也表现出协同作用。此外，野生型秀丽线虫在单独或联合的化学胁迫后HSP70蛋白水平均显著上升。我们的实验结果首次证实了砷/草甘膦混合物和砷/铜混合物对秀丽线虫的影响。

关键词：砷 生态毒理生物指示剂 秀丽线虫 混合物毒性 热激蛋白

自由生长的土壤秀丽线虫因为与自然环境毒素和多种压力源（如重金属、农药、温度）的接触而成为环境干扰的有用生物指示剂（Boyd和Williams，2003年；Peredney和Williams，2000年）。基于其完整的基因组序列的可用性、体积小、在实验室中易于操作、与人类疾病相关的独特生物学特征、对不同压力的敏感性以及特征性的基因表达与表型反应的功能关系，秀丽线虫已经成为一种用于生态毒理学研究的优秀动物模型（Leung等人，2008年）。

事实证明，重金属和农药造成的环境污染是全球主要的环境问题，在各个方面都威胁着植被、野生动植物和人类的健康（Bellinger，2008年；Jayasumana等人，2015年；Lushchak 等人，2009年；Nava-Ruiz等人，2012年）。草甘膦（GPS）是一种广泛使用的高水溶性除草剂。它在浓度为0.308-38.7 micro;g/g时，对多年生草本植物、莎草和阔叶杂草来说是相对非选择性并且非常有效的（Blackburn和Boutin，2003年），它能抑制芳香族氨基酸的生物合成，解除莽草酸途径的调控，从而干扰正常的生化过程（Reddy等人，2008年）。砷（As）通常存在于环境和生物系统中，它被认为是最危险的有毒非金属之一，约10mu;M剂量的砷的毒性可能会通过结合和交联细胞蛋白而导致一系列不良健康问题（Hossain等人，2000年），从而影响生物体内的多种途径，包括生长因子的表达、抑制细胞周期检查点蛋白质、促进细胞凋亡、抑制DNA修复和增加氧化应激。微量营养素铜（Cu）在几个新陈代谢途径中充当一个酶辅因子的角色，但是，高浓度的铜（例如0.13 mM）对生物体是有毒的（Wang等人，2013年）。它可能会干扰正常的生理代谢过程，例如光合作用、叶绿素含量的降低、呼吸过程和蛋白质合成（He等人，2005年）。

生物体已经进化出多种机制来帮助其不断完成适应自然环境变化和应激反应的生理变化，包括产生称为热激蛋白（HSPs）的应激蛋白（Lindquist，1986年；Wang等人，2007年）。热激蛋白是分子伴侣蛋白，存在并保存于一切生命形式中，包括细菌、酵母、植物、线虫、果蝇和哺乳动物细胞（Guttman和Gorovsky，1979年；Kelley和Schlesinger1978年；McAlister等人，1979年;Miller等人，1979年，Ritossa，1996年；Snutch和Baillie，1983年）。ATP依赖的热激蛋白（HSP）（包括HSP90、HSP70和HSP40）在应激条件下与ATP独立的分子伴侣，如小热激蛋白（sHSP）一起上调，以防止外源蛋白的聚集，从而调节蛋白的结构。新合成的蛋白质有助于ATP依赖性折叠，并稳定应力破坏的蛋白质（Candido， 2002年；Hartl等人，2011年；Kim等人，2007年；Lindquist和Craig，1988年；Mathew和Morimoto，1998年）。因此，蛋白质表达终点不仅灵敏并可用于估计有毒物质对预期动物种群的影响，而且还可以提供有关这些有毒作用的分子机制的见解。

在水生环境中，污染物以复杂的化学混合物的形式存在，并且基于化学成分之间的相互作用，可能导致加性、协同或拮抗毒性（Jonker等人，2004年; Olmstead and LeBlanc ，2005年）。多项研究显示秀丽线虫在接触草甘膦、砷和铜作为单独的化学物质时的毒性作用（Anbalagan等人，2013年; Martinez-Finley and Aschner，2011年）；以及作为有毒混合物时对水生物种（Cedergreen等人，2008年；Loureiro等人，2010年）以及一些陆生动物（Loureiro等，2009年；Santos等，2010年）的毒性作用。然而，仍然缺乏有关砷/草甘膦混合物和砷/铜混合物联合作用的信息，最近，我们研究了温度和重金属毒性对秀丽线虫繁殖、死亡率、生长、发育、行为和应激蛋白的作用（Wang and Ezemaduka，2014年；Wang等人，2014年）。在本研究中，我们的目的是分别研究砷、铜和草甘膦以及砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物对在急性致死浓度和半致死浓度中的秀丽线虫的生态毒理学终点的影响。

材料和方法

将布里斯托尔N2野生型秀丽线虫菌株（从秀丽线虫遗传学中心获得）维持在线虫生长培养基（NGM）上，并使用标准方法进行培养（Brenner，1974年）。为了获得与年龄同步的线虫种群，将妊娠的蠕虫从平板上冲洗到离心管中，并与漂白混合物（5M NaOH：5％HClO = 1：2）混合。

在确定毒性浓度之前，先对每种测试化学品的浓度进行了初步实验，测试并确认了每种化学药品和混合物在水溶液中的稳定性。检测溶液中铜、砷、草甘膦浓度水平的方法已在其他地方进行了详细介绍（Wang等人，2007年；2014年；2015年）。简而言之，根据中华人民共和国的渔业用水标准（GB 11607-89）（Wang等人，2007），使用分析级的试剂测定了铜和砷的浓度。通过高效液相色谱法（Waters 600E,Milford,MA,USA）来分析待测溶液中草甘膦的浓度水平。使用Sigma Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯）的标准物为对照绘制标准曲线。为了验证准确性，使用了内部指标并分析了三个重复样品。砷、铜、草甘膦的检出限为分别为0.001 mg / L、0.001 mg / L和0.01 mg / L。

根据Wang等人的研究，将野生型秀丽线虫置于不同浓度的铜、砷、草甘膦24小时后进行致死性测试（2014年，2015年）。每个实验由五种有毒浓度组成，将大约9-11天（平均10天）的成年N2野生型线虫转移到装有0.5 mL测试溶液的24孔微量滴定板中，线虫在20°C下孵育24小时，并设置三个重复实验组。

在使用砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物进行致死性测试中，步骤基本与单一化学试剂的致死性测试相同。但是，混合物测试中使用的各种有毒物质的浓度由单一化学试剂实验测试的结果确定。在联合毒性试验中，使用浓度分别为1/5 LC50、1 / 2 LC50和LC50的混合物。

线虫分别在1 / 1000 LC50、1 / 100 LC50和1/10 LC50的半致死浓度的砷、铜和草甘膦以及砷/铜混合物和砷/草甘膦混合物中处理24小时，以观察头部抽动反应、繁殖和热休克蛋白表达。头部抽动实验就如我们先前所述的方法进行（Wang等人，2015年），记录头部抽动一分钟。抽动定义为身体中部弯曲方向的变化。 将单一实验的秀丽线虫放在24孔组织培养板的单个孔中来测定母体大小，就像之前所述（Wang and Ezemaduka，2014年），并在化学物质或混合物处理的情况下孵育24小时，每隔2天将线虫转移到新鲜的普通（无毒）平板上，并在转移后24小时对子代进行计数，出于统计目的，至少进行了3次重复。

用经典的三明治酶联免疫吸附测定（ELISA）分析野生型秀丽线虫中的HSP70和HSP90蛋白的表达（Wang and Ezemaduka，2014年）。简单说，就是在96孔微量滴定板上加入100mu;L线虫蛋白样品（10mu;g/mL），然后用箔纸覆盖并在4°C下孵育过夜。洗涤除去所有未结合的物质后，将100mu;L抗HSPs多克隆抗体以1：5000的比例加入孔中，然后在37°C水浴中孵育1小时。再次洗涤后，将与辣根过氧化物酶（IgG-HRP）以1：15,000的比例偶联的山羊抗兔抗体加入孔中，并在37°C水浴中孵育1小时。最后一次洗涤后，将TMB微孔过氧化物酶底物添加到孔中，并在黑暗中孵育15分钟，并用50mu;L的2 mol / L磷酸（H2SO4）终止反应。用微量滴定板读数器（BioRad Model 550TM，Hercules，CA USA）在450 nm下测量颜色强度，每个样品独立进行三次重复以获得平均值，并以对照（无毒）作为参考来计算HSP表达量的相对值。本文中的所有数据均表示为平均值plusmn;标准差，使用对数转换生成每组重复的半致死浓度作为SPSS 12（SPSS Inc, Chicago, IL, USA）的三个重复实验组的平均值，并针对单个LC50计算了标准偏差和变异系数。使用Origin 8.0软件（Northampton, MA, USA）的Fisher最低显著性差异(LSD)法进行方差分析（ANOVA），然后确定两组之间差异的显著性，0.05和0.01的P值分别被认为具有显著性和高度显著性。

结果和讨论

秀丽线虫中砷、铜和草甘膦的24小时半致死浓度分别为130.5 mg / L、85.1 mg / L和18.5 mg / L。根据急性毒性测试的结果，为半致死条件选择了三种浓度，分别对应于获得的24小时LC50值的1/5 LC50、1 / 2 LC50和LC50，这些浓度分别为：砷：26.1 mg / L、65.25 mg / L和130.5 mg / L；铜：17.0 mg / L、42.6 mg / L和85.1 mg / L； GPS：3.7 mg / L、9.25 mg / L和18.5 mg / L。

图1显示了砷和草甘膦对秀丽线虫幼虫在测得的砷浓度和24小时草甘膦半致死浓度为1/5 LC50、1 / 2 LC50和LC50的处理下的联合毒性。砷和草甘膦的作用导致在所有测得的草甘膦半致死浓度中的死亡率的增加（图1），在草甘膦的1/5 LC50和1/2 LC50浓度时，草甘膦和砷的混合毒性显示出协同毒性，但随着砷作用浓度的增加，协同毒性显著增加（图1a，图1b）。值得注意的是，在高浓度的草甘膦（即LC50）和1/5LC50浓度的As混合物作用下，相互作用效应仍显示出协同毒性。但是，这种影响在砷浓度为1/2LC50处减弱（图1c），对于砷和铜的混合物也观察到了类似的相互作用模式（图2），协同作用在铜浓度为1/5LC50处最大（图2a），这取决于砷的半致死浓度。在铜浓度为1/2 LC50时，砷和铜的化学混合物的协同作用逐渐减弱（图2b），在铜的LC50浓度下甚至进一步减弱（图2c）。

图1：秀丽线虫在24小时的不同浓度的砷和浓度分别为1/5 LC50、1/2 LC50和LC50的草甘膦处理下的联合毒性。 计算预测浓度增加了单一物质的毒性作用，而实验显示其有协同作用（即毒性高于预期）和拮抗作用（即毒性低于预期）

图2：秀丽线虫在24小时的不同浓度的砷和1/5 LC50、1/2LC50和LC50浓度的铜的处理下的联合毒性。计算预测浓度增加了单一物质的毒性作用，而实验显示其有协同作用（即毒性高于预期）和拮抗作用（即毒性低于预期）

基于活生物体的生长和繁殖受到多种环境压力的不利影响的事实，生理水平的变化（例如生长、繁殖、进食、运动或行为）已经被证实是秀丽线虫的生态毒理学评估的有用终点（Anderson等人，2001年）。为了将农药/重金属混合物的毒性作用纳入风险评估程序中，需要更多有关此类化学混合物在急性使用的各种终点的信息例如繁殖、寿命、应激蛋白表达、死亡率和头部抽动。在这个研究中，既研究了运动的终点（即头部抽动）也研究了繁殖，

选择了三种浓度，对应为1 / 1,000 24h-LC50、1 / 100 24h-LC50和1/10 24h-LC50，作为研究的半致死浓度。这些浓度分别是：砷：0.13 mg / L、1.31 mg / L和13.05 mg / L；铜：0.09 mg / L、0.85 mg / L和8.51 mg / L；草甘膦：0.02 mg / L、0.19 mg / L和1.85 mg / L。

砷和草甘膦单独以及作为混合物对头部抽动的影响如图3所示。在所有测试浓度的砷/草甘膦混合物中，头部抽动与对照组相比都减少了。此外，头部抽动的减少与LC50浓度有关，在砷单独或联合化学胁迫下处于最高浓度（1/10 LC50）后，其头部抽动明显降低。重要的是，暴露于砷/草甘膦（图3a）或砷/铜（图3b）混合物的秀丽线虫的头部抽动减少与处理浓度表现出协同趋势。值得注意的是，在单独的铜在浓度较低（1/100 LC50）处理时出现了拮抗趋势。

图3a：在砷、草甘膦、砷/草甘膦混合物处理下以及对照组的秀丽线虫的头部抽动行为；图3b：在砷、铜、砷/铜混合物处理下以及对照组的秀丽线虫的头部抽动行为，条形代表标准误差（N=

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