双生病毒Rep蛋白对植物DNA甲基化机制的干扰和对转录后基因沉默的抑制外文翻译资料

 2023-01-06 11:01

双生病毒Rep蛋白对植物DNA甲基化机制的干扰和对转录后基因沉默的抑制

郑倩倩 生技142

摘要：

胞嘧啶甲基化修饰是一种表观遗传标记，促进基因沉默，并且在对转座子和入侵DNA病毒的基因组防御中起重要作用。之前数据表明，单链DNA病毒联体病毒科，它通过对植物甲基周期的正常运转的干扰，阻止了甲基化介导的转录基因沉默（TGS）。

在这里，我们描述的是通过使用新的防御双生病毒策略，通过甲基化转移酶1（MET1）和染色体甲基化酶3（CMT3），在局部和全身感染的植物组织中的表达，从而降低宿主维持的DNA甲基的表达，

我们证明了抑制DNA甲基的病毒介导的转录基因沉默是由于双生病毒物种。此外，我们确定Rep蛋白（复制相关蛋白）负责抑制植物内源的MET1和CMT3，另一病毒蛋白，C4，负责辅助MET1的下调。通过亚硫酸氢盐的测序分析表明，Rep蛋白表达引起的CG位点的DNA甲基化水平大幅减少。

我们的研究结果表明，Rep蛋白的是病毒复制必不可少的，通过从不同的机制抑制TGS活性显示对双生病毒侵染过程中的作用。

简介

双生病毒是由环状，单链DNA构成的一类的植物病毒，其能感染植物种类范围广泛。（罗哈斯等人，2005）。根据它们的基因组组份，寄主范围及虫媒双生病毒可分为4属，菜豆金色花叶病毒属，曲顶病毒属，番茄伪曲顶病毒属和玉米线条病毒属，（Fauquet等，2008年）。其中最大的属种是菜豆金色花叶，是由单组份和双组分基因组构成的，由六至七个基因编码成的。双生病毒复制几乎完全取决于寄主的因素。病毒基因组仅编码两种蛋白质，在病毒的复制中发挥作用。双生病毒复制几乎完全取决于宿主的因素。病毒基因组仅编码两种蛋白质在病毒的复制中发挥作用：Rep蛋白，是这一进程（埃尔默等，1988年）和C3蛋白（也称为AC3复制增强蛋白）），能增强病毒DNA的累积（桑特等，1990年）。双生病毒在感染细胞内通过滚环复制方式（RCR）进行双链DNA的复制，虽然有些在DNA重组时进行依赖性复制（RDR）（Jeske，2009年）。

RNA沉默是植物重要的抗病毒机制。（鲁伊斯，费雷尔和Voinnet，2009;丁，2010; Llave，2010）在感染后，植物可以处理病毒RNA的小干扰RNA（siRNA），并利用这些siRNA指导特异的抗病毒沉默。源于病毒致病后siRNA的研究，能导致细胞质水平的RNA沉默，这被称为转录后基因沉默（PTGS），对于RNA病毒和DNA病毒也有对抗PTGS的机制，双生病毒编码的小分子蛋白（即C2，C4和V2）在不同的水平上，抑制siRNA的扩增，干扰siRNA与基因沉默相关途径蛋白的结合（PTGS途径的蛋白）（DiazPendon等 2008年；拉贾等，2010; Burgyan＆Havelda，2011年）。此外，病毒DNA复制和转录受到siRNA介导的甲基化抑制，导致转录后基因沉默（TGS）。对于双生病毒的RNA沉默的发现是基于大量的实验观察：（1）感染期间双生病毒DNA被甲基化，并且甲基化与宿主恢复相关联（Hagen等，2008; 拉加等，2008; 罗德里格斯内格雷特等，2009; Paprotka等人，2011）；(2) 原生质体内对双生病毒DNA的甲基化大大降低了烟草病毒复制，这是通过病毒的转录抑制（Brough的等，1992; 叶尔马克等人，1993）；（3）由双生病毒启动子驱动的转基因可以被甲基化，植物体内同源的基因在双生病毒接种后可以被植物沉默（Seemanpillai等人，2003;卞等人，2006）；（4）利用拟南芥突变体获染色质甲基化作为对双生病毒一个直接的表观遗传防御证据（拉贾等人，2008年）。这些研究表明，能够引发基因沉默过程的信号是生成的特异性序列。推测双生病毒还可编码TGS的抑制剂。到目前为止，只有一个病毒基因组编码的蛋白质，C2显示出可以抑制TGS，通过干扰甲基化酶的正常运转来减少植物DNA的甲基化（布赫曼等，2009; Zhang等，2011）。

目前，已推出两种C2对TGS的抑制机制的猜测：（1）抑制腺苷激酶（ADK; Wang等人，2003）和（2）减弱S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶-1蛋白酶体介导的降解（SAMDEK1; Zhang等，2011）。此外，双生病毒的卫星病毒beta;分子编码的C1蛋白也显示出调节甲基化水平的功能，它是通过抑制S-腺苷高半胱氨酸水解酶的活性（SAHH; Yang等人，2011）。

在哺乳动物中，DNA甲基化几乎完全发生在对称的CG前后，而在植物中，DNA甲基化发生在所有序列的前后：CG，CHG和CHH（其中H为A，T或C）。从头合成的DNA甲基化是按甲基结构催化重排酶2（DRM2），一旦甲基被建立，它是由三个不同的酶保持：甲基化转移酶1（MET1），甲基化转移酶3（CMT3）和DRM2本身，它可以保持CG，CNG和非对称CHH的甲基化，（雅各布森等，2010年）。DNA甲基化是植物中稳定表观的遗传标记，甲基化模式特征可持续在子代中保持。在植物发育期间，可以检测到植物基因组中的整体甲基化水平的变化。在缺乏甲基化水平维持的作用下，可通过DNA复制或者主动出去甲基化来减少甲基化的被动发生。主动去甲基化是植物通过在与碱基切除修复组合（BER）途径实现DNA糖基化酶活性（法律与雅各布森，2010）。DEMETER（DME）和沉默抑制1（ROS1）是属于拟南芥DNA糖基化酶的一个位点，还包括成员DEMETER样2（DML2）和DEMETER-LIKE3（DML3），这些基因的突变可导致特定基因位点DNA甲基化序列的增加。

拉贾等人证明了拟南芥胞嘧啶甲基化突变体（DRM1 DRM2双突变体和CMT3和MET1单突变体）易受双生病毒感染，而且病毒甲基化在这些突变体的显著降低。在这项研究中，证据表明，植物DNA病毒，正如动物的DNA病毒（德索萨等，2010），能够改变宿主的DNA甲基化的表达水平。具体地说双生病毒通过抑制维护DNA甲基化的MET1和CMT3来降低植物的转录水平。数据表明Rep是参与维持DNA甲基的压制的主要病毒蛋白，并抑制TGS的发生。这种策略是Rep与C2蛋白通过干涉植物的甲基化周期来发挥作用。综上所述，结果表明，双生病毒家族的已经发展了多个独立的策略，用来克服该宿主防御反应。此外，我们的数据揭示了双生病毒Rep蛋白作为TGS一种新型的功能是抑制改变植物的表观基因组，并证明这种致病因素在感染过程超越DNA复制的作用。

结果

双生病毒降低了本氏烟草DNA甲基的转录水平

近年来，一些研究表明，动物DNA病毒通过改变从头DNA甲基的表达来利用宿主介导的甲基化作为一种自身优势的机制（德索萨等人，2010）。我们通过分析本氏烟草DNA甲基和去甲基化酶在双生病毒感染过程中的表达，来确定植物DNA病毒是否采用类似的策略。如第一步骤中，我们扩增和克隆测序的cDNA上的片段，通过参考已登录的NbMET1（GenBank登记序列登录号FJ222441）和拟南芥的CMT3和DRM2同源物的保守区以及烟草和番茄的序列设计引物。从本氏烟草的总RNA通过反转录PCR（RT-PCR）中得到NbMET1，NbCMT3和NbDRM2的cDNA片段，他们显示出高程度的同源性。ROS脱甲基酶是由拟南芥单基因（AtROS1）编码，若干同源物都已在茄科植物的基因组中确定：四个普通烟草（NtROS1，NtROS2a，NtROS2b和NtROS3;佐野，2007年）和两个番茄（的S.lycopersicum）（SlROS1-Solyc09 g009080和SlROS2b-Solyc10 g083630）。使用特异性引物对普通烟草的ROS基因，我们能够隔离cDNA从同源那克隆的NtROS1/ SlROS1和NtROS3/ SlROS2b两个部分。这个发现表明，我们命名NbROS1和NbROS2两个ROS同系物也存在于本氏烟内。

在第一种方法中，我们确定DNA甲基和去甲基化酶的转录物水平是否在局部感染中被改变。本氏烟草的叶子被番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）；番茄黄化曲叶病毒；非洲木薯花叶病毒（ACMV）和番茄金色花叶病毒（TGMV））感染导致轻度损伤。从叶斑块中提取总RNA并用于测量DNA甲基NbME1，NbCMT3和NbDRM2和去甲基NbROS1和NbROS2的mRNA表达水平。用空载体（模拟）来接种农杆菌作为对照。正如图中所示在双生病毒被感染的任何每个样品与对照样品相比，本氏烟草叶子上维持DNA甲基的表达水平的NbME1和NbCMT3表达明显降低，从头甲基化基因NbDRM2仅在被ACMV感染后降低了表达。有趣的是，也观察到NbROS1和NbROS2的mRNA水平减少（图1A）。

通过Southern印迹分析和RT-PCR来检测病毒DNA的积累和表达，也证实了所有检测的双生样品都进行了复制。这些结果表明，双生病毒下调了植株维持的DNA甲基NbME1和NbCMT3的mRNA表达水平；然而， ACMV除外，这些病毒不改变从头DNA甲基化的NbDRM2的表达。

为了确定当植物基因组全身性甲基化时，是否也改变了DNA的表达，我们通过感染转基因2IR-GFP转基因植物TYLCV（Morilla等人，2006;洛扎诺 - 杜兰等人，2011B）。这些Rep融合了绿色荧光蛋白（GFP），可以在一定的时间内观察到其组织的定位，其中病毒也会被复制。由于双子病毒会降低植物细胞中转基因DNA的复制，所以可以使用这些转基因植物来用于高灵敏度的检测植物全身双生病毒感染过程中发生的DNA甲基化的表达变化。植物用TYLCSV接种，通过收集在组织中基因组的GFP。作为对照，从模拟受感染的植物中收集了相似的发展阶段的等效叶片组织。总RNA在35天接种后（DPI）萃取，并用RT-qPCR的测定NbMET1，NbCMT3，NbDRM2，NbROS1和NbROS2的转录水平。NbMET1和NbMET3在模拟接种后系统感染的中转录水平的明显减少了约50%（图1B）。也检测到了该DNA脱甲基酶BROS1的下调，但出乎意料的是，NbROS2的转录水平仅轻微减少，这和局部感染期间是不一样的（图1b）。通过RT-qPCR查证Rep表达（图S2C），检测到NbDRM2水平无显着变化。在拟南芥中的胞嘧啶94％已甲基化（Cokus等人，2008），这些发现确认的表明这两个植物基因在双生病毒感染后是负责维持对称DNA甲基化下调。

下调NbMET1和NbCMT3取决于Rep，而不是对先前已知的双生病毒沉默的抑制机制。

通过TYLCSV感染的方法来确定病毒蛋白的表达是否引起维持DNA甲基转移酶基因的表达下调，我们构建了不同版本的TYLCSV，含有突变在已知的三个双生的沉默抑制机制：C2、C4和V2。烟草叶片与野生型C2（C2T2C；Lozano—杜兰等人，2011A），C4（c4t2c）或V2（v2t2g）无效突变体接种农杆菌后，并用RT-qPCR检测其转录水平。C2或V2下调NbMET1和NbCMT3水平的病毒与野生型是相同病毒,这表明,这两种蛋白质是抑制DNA甲基转移酶的必要蛋白(图2)。C4突变抑制NbCMT3程度类似于野生型病毒,但其抑制NbMET1明显较弱(64%的基底C4突变的表达式与之相比,39%的基底为野生型TYLCSV表达式;实验证实,这种差异在统计上显著P lt; 0.01;图2)。这一结果表明，NbME1抑制是部分地依赖于C4中，可能还有另一种病毒蛋白参与。为确保在NbMET1或NbCMT3表达变化不是因为能够在突变体复制的能力的差异，我们确定病毒DNA和Rep转录在接种组织中的水平，和野生之间并没有检测到显着的差异型和突变病毒（图S3A，B）。为了进一步研究这些结果，我们使在本氏烟草叶的病毒蛋白过表达，如图2（b）所示，农杆菌用C2，C4或V2的载体表达渗透与感染中叶斑块相比并没有导致在NbMET1或NbCMT3转录物的积累减少。表达的病毒记录通过RT - PCR证实 (图S3C)。总之,我们的研究结果表明,没有一个知道TYLCSV沉默抑制如何参与NbCMT3的下调。似乎只有C4在抑制中发挥辅助作用NbME1，因为它的存在是不足够改变此DNA甲基的表达，但它需要被野生型病毒感染后才检测到NbMET1抑制的水平。表现出功能上的相似复制起始蛋白的双生病毒代表，如多瘤病毒大T抗原（TAG）和腺病毒的E1a通过pRB（视网膜母细胞瘤）/ E2F途径（McCabe等人，2006激活MET1同源（DNMT1，DNA甲基转移酶1）。Jung等人，2007）。有趣的是，在植物中激活的MET1依赖性印迹基因被控制，其他的机制是通过AtMET1的转录抑制通过成视网膜细胞瘤依赖性途径（于连等人，2008）。据报道作为双生病毒Rep和植物RBR同源物之间的相互作用是全感染（汉利-鲍登等人，2004）必不可少的，我们想知道双生病毒Rep是否参与下调MET1。不幸的是，我们无法使用Re拍的无效突变体感染实验，因为Rep蛋白是病毒复制所必需的。因此，我们让在本氏烟草叶中TYL-CSV的Rep蛋白过度表达。由于Rep的开放阅读框（ORF）涵盖C4的ORF，我们产生两种不同的构建体：一个从相同的载体中表达两种蛋白质（35S：代表 -C 4），另一个表示仅代表（35S：代表-C 4）。在第二个构建体中，有人提出该突变过早接触终止密码子截断了C4蛋白后9个氨基酸，并没有改变Rep（C2437G）蛋白氨基酸序列。NbMET1和NbCMT3通过RT-qPCR在农杆菌接种的组织测定mRNA的表达水平。结果表明：Rep蛋白的过表达减少了NbME1和NbCMT3的mRNA的表达水平，这表明此病毒蛋白是负责下调的维持的DNA甲基化（图2b）。因为RepC4或Rep C4的表达抑制（c.55-60％）水平相似导致C4的独立，才形成NbCMT

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