噻苯隆对酒红杜鹃和西洋杜鹃体外形态发生反应的影响外文翻译资料

 2023-01-07 10:01

噻苯隆对酒红杜鹃和西洋杜鹃体外形态发生反应的影响

原文作者：Yulianna G. Zaytseva。 Tatyana V. Poluboyarova

摘要：噻苯隆( 噻苯隆 )诱导的芽器官发生在试管内冬季耐寒植物的衍生叶片外植体。采用添加不同浓度安德森营养培养基和液体脉冲处理两种噻苯隆应用方法，对酒红杜鹃和西洋杜鹃进行了研究: 在Anderson营养培养基中添加不同浓度的药物和液体脉冲处理法。新芽再生的最高频率 (93%)在经历了两阶段培养过程中, 叶外植体暴露于 1.0mu;mm 噻苯隆 后, 得到了最大的单植体 (24.6) 的幼苗数 (24.6), 其次是无 噻苯隆 培养。噻苯隆 浓度分别为0.5 和 1.0mu;m, 对酒红杜鹃的叶片外植体有效, 诱导60和85% 再生频率, 每种外植体分别诱导30.0 和25.0 芽。用 30mu;m 噻苯隆 对叶外植体进行4小时的液-脉冲处理, 仅对酒红杜鹃有效。组织学分析显示, 叶片基部正面表皮细胞参与了两个基因型的新芽再生。然而, 西洋杜鹃的芽器官是由突起发育而来的, 而酒红杜鹃的芽器官发生是通过形成胚状结构而形成的。采用吲哚-3-丁酸液脉冲法对微芽进行离体生根处理，获得了两种基因型的最佳生根条件。开发了一种高效的酒红杜鹃和西洋杜鹃繁殖系统。 这是具有良好遗传转化前景的耐寒基因型。

关键词：杜鹃；噻苯隆；叶外植体；再生芽；组织学分析。

  1. 介绍

杜鹃是高度观赏性的植物, 广泛用于世界各地的园林绿化。然而, 尽管存在一些著名的抗寒物种和品种, 但在西伯利亚恶劣气候条件下的城市种植中, 这些灌木很少使用。一个是西洋杜鹃(subsection Rhodorastrum Maxim.)， 是来自俄罗斯远东锡霍特-阿林山脉森林山坡上的一种野生物种。其具有花冠色变异性 (粉红色、白色、奶油色、深紫色) 的半常绿灌木的冬季耐寒性及其初春开花的时间使其成为最有前途的品种之一, 可用于培育新型品种。此外, 该物种对广泛的土壤 ph 值具有相对耐受性, 这在杜鹃中是一种罕见的品质。尽管有这些特点, 但西洋杜鹃此前并没有被纳入养殖计划 (vrishch 等人, 2010年)。另一个有趣的杜鹃是产于北美东部山区的大草原。它被认为是冬季耐寒、耐阳光、常绿杜鹃繁殖的重要资源 (van veen, 1969年)。

克隆微繁殖是为许多常绿杜鹃品种开发的, 是大规模生产有价值基因型和品种的最有效方法（McCown and Lloyd 1983; Preece and Imel 1991; Iapichino et al. 1991, 1992; Eeckhaut et al. 2010).。然而, 将这些技术应用于西伯利亚和远东野生物种繁殖的尝试很少, 这些尝试中使用的协议不适合商业生产。杜鹃离体外植体的培养是一种很有前途的大规模繁殖方法 (Tomsone and Gertnere 2003; Pavingerova 2009)。此外, 叶片培养物作为体外形态发生研究的模型, 因为叶片中缺乏顶端分生组织提供了诱导广泛的形态反应的机会 (Lo et al. 1997; Woo and Wetzstein 2008)。杜鹃叶培养的另一个应用是遗传转化获得改良基因型(Preece and Imel 1991).

已知在木本植物分化细胞中发生形态的最有效的诱因之一是被取代的噻苯隆(TDZ)。一种取代苯基脲 (Huetteman and Preece 1993; Murthy et al. 1998; Guo et al. 2011). 。噻苯隆的高活性与其影响内源性植物生长调节剂（PGR）水平的能力有关(Murch and Saxena 2001)。

噻苯隆诱导杜鹃叶片培养体外形态发生可通过直接(Samyn et al. 2002;Tomsone and Gertnere 2003)或间接器官发生(Pavingerova 2009; Hebert et al. 2010)，和体细胞胚胎发生(Vejsadovaacute; and Petrova 2003)。因此, 杜鹃叶培养再生系统的建立应伴随着组织学分析, 以澄清形态发生的类型。虽然噻苯隆对西洋杜鹃和酒红杜鹃叶外植体与其他 pgr 的形态潜能的影响有一定程度的研究(Tomsone and Gertnere 2003;Pavingerova 2009), 目前还没有对R. sichotense进行体外研究。

因此, 本研究的目的是: (a) 分析不同浓度噻苯隆的处理类型 (包括液体脉冲) 对叶片外植体再生潜力的影响; (b) 确定利用组织学分析研究基因型, (c) 为西洋杜鹃和酒红杜鹃的繁殖制定有效的繁殖方案。

  1. 材料和方法

植物材料 在安德森(AM) (Anderson 1984)的中型生物技术实验室 (CSBG RAS, Novosibirsk, Russia)的集合中， 保存了酒红杜鹃 和西洋杜鹃，其中含有0.6% 的 Bactoreg;琼脂 (PanReacreg;, Barcelona,Spain)、3% 的蔗糖 (Shostka Chemical Reagent Factory,Shostka, Ukraine), 24.5mu;M 2-异戊烯腺嘌呤和5.7mu;M 丁二醇-3-乙酸 (均来自ICN Biomedicals, Aurora, Ohio)) ，每6周做四个片段，然后将具有三个节点的微插枝转移到琼脂凝固、无激素 am (am0), 并培养为两个片段 (每次做四周)。高压灭菌前, ph 值介于调整为 5.0 (121°C, 1.05 千克 cmminus;2), 并在高压灭菌后的培养基中加入所有 pgr。在冷白色荧光灯 (Philips, Pila, Poland)下, 培养罐 (每只容器15毫升) 以40mu;mol 的强度保持在培养罐 (每只容器15毫升介质) 中, 强度为 40mu;mol mminus;2 sminus;1具有16h 的光周期

噻苯隆 对叶片外植体幼苗再生的影响 从 酒红杜鹃和西洋杜鹃的体外微克隆中提取的第一对叶柄幼叶。本研究切除了在 am0 上培养的病药, 并作为外植体。为了排除叶柄上残留的腋生分生, 在立体显微镜下去除叶片外植体 (Lomo, MSP-1 var.1, St. Petersburg, Russia)。叶外植体在琼脂凝固表面上放置正面。为了研究 噻苯隆 (plant cell culture tested, BioReagent,Sigma-Aldrichreg;) 对再生能力和形态发生的影响, 使用了两种类型的噻苯隆处理: (a) 在 am 上直接外植体培养, 辅以各种浓度的噻苯隆(0.1, 0.5,1.0、5.0 或10.0 mu;M) ； (b) 在 3000mu;M噻苯隆的水溶液中对叶片外植体进行4次脉冲处理, 然后在 am0 上进行培养。高压灭菌前, 介质的 ph 值调整为 5.0 (121°C; 1.05 千克 cmminus;2)。在高压灭菌后将噻苯隆添加到培养基中。在温度为23plusmn;2°C、强度为40mu;mol mminus;2 sminus;1、光周期为16h的冷白色荧光灯下，将培养基保持在15 ml培养瓶中。培养时间为15周。每个治疗包括10个外植体和3个复制体。利用立体发现V12显微镜和AXIOCAMHRC摄像机对再生剂的形态进行了研究 (all from Carl Zeiss,Gottingen, Germany).。

组织学分析 实验开始后0 d、7 d、10 d、12 d、14 d、21 d、35 d和8 wk，在添加1.0mu;M 噻苯隆的AM上培养的叶片外植体，并用光学显微镜进行检查。外植体固定在冰醋酸（99.9%）、福尔马林（40%）和乙醇（96%）中，比例为7:7:100(v/v/v)。根据Pausheva（1988）将样品脱水并包埋在Paraplast（Sigma-Aldrich）中，并使用切片机（HM-325 Microm，Walldorf，Germany），以7mu;m切片。切片用埃利希苏木精染色15分钟和0.1％苯胺蓝(all dyes from Sigma-Aldrichreg;)染色3分钟（Pausheva 1988）。组织学分析采用Axioplan 2 imaging、Axioskop-40、camera AxioCam MRc5、AxioVision 4.8软件的显微镜(all from Carl Zeiss).

嫩枝伸长、生根和驯化 将不定芽团转移到AM0进行伸长，8周后计算每个外植体的芽数（长度ge;5 mm）。为了刺激根系形成，用148.0mu;M IBA（ICNBiomedicals）无菌水溶液进行4小时预处理。为了生根，将预处理的再生剂放在AM0上，或者放在泥炭（pH4.0–5.0）和沙子（1:1；v/v）的混合物中。在高压灭菌前，将试管生根培养基的酸碱度调至5.0。6周后计算生根频率、根数、根长、次生根数和茎长。每次治疗使用30个重复的再生剂。在泥炭和沙土(1:1;v/v)在高度潮湿的条件下。植物被保持在23plusmn;2°C下冷白色荧光灯(Philips)，维持强烈的27mu;mol m -2 sminus;1和16小时光照。将驯化后的植株移栽到直径10厘米、土壤pH 5.5-6.5的花盆中，移栽到温室中。

统计分析 所有数据均采用单因素方差分析法，利用Statistica 8（Statsoft Inc.，Tulsa，OK）评估治疗差异和相互作用。平均值之间的显著性通过邓肯检验进行检验（p=0.05）。数据表示为平均值plusmn;SE。

图 1 西洋杜鹃在 1.0mu;M噻苯隆培养中，对芽形态发生的影响：（a）14 d形成的突起；（b）21 d形成的突起和芽原基；（c）15周培养后发育不良的芽簇。（d）8周后在A.M.0上拉长拍摄集群。bp芽原基，ds分化芽，pr突起

  1. 结果与讨论

噻苯隆对外植体芽再生的影响

尽管有报道称噻苯隆对体外许多木本植物的生长有很高的效果（Murthy等，1998），但只有少数关于这种合成细胞分裂素与各种植物生长调节剂结合使用微克隆的叶外植体对杜鹃花微繁殖的影响的研究(Mertens et al. 1996; Tomsone and Gertnere 2003)。本研究是国内外首次从酒红杜鹃和西洋杜鹃的离体叶片外植体中进行植株再生的研究。仅使用噻苯隆治疗的酒红杜鹃和西洋杜鹃。

在含有0.1、0.5或1.0mu;M 噻苯隆的培养基上培养14 d后，在叶片和叶柄底部的西洋杜鹃叶外植体的近轴侧形成可见突起（图1A）。长时间的栽培导致了该区突起和芽原基形成的数量增加（图1b）。然而，由浅绿色突起和玻璃化的芽原基组成的不定芽团仅在8周后形成。到第15周，萌芽发育（表1）。西洋杜鹃叶片培养的再生过程是非同步的：在不定簇中，无论是发育早期的芽原基还是完全形成的芽原基，都有长度大于5毫米的分化良好的芽（图1c）。在1.0mu;M 噻苯隆的培养基中，再生频率最高（93%），组团数量最多。将噻苯隆浓度增加到5.0mu;M会降低再生速率，并伴随着愈伤组织的形成（表1）。在10.0mu;M的噻苯隆处理下，大多数叶片外植体变成褐色并死亡。30mu;M 噻苯隆液脉冲处理4h，然后在AM0上培养，没有效果，也没有诱导西洋杜鹃叶片外植体形成芽（表1）。

表 1 培养15周后,不同浓度和不同处理对西洋杜鹃和酒红杜鹃形态发生反应的影响

酒红杜鹃叶片外植体的叶柄下半部分在10-12 d暴露于AM后变红，补充0.1、0.5或1.0mu;M 噻苯隆，并在噻苯隆脉冲处理后变红。进一步的培养导致从红色区域形成胚状和发育不全的异常芽（图2A,B）。新芽出现，新生芽的集约化导致了短芽球形簇的形成（图2E）。用5.0mu;M噻苯隆处理后，叶片正面的胚状结构直接再生（图2C）。经15周培养后，脉冲处理30.0mu;M 噻苯隆和1.0mu;M 噻苯隆连续培养处理的再生率最高（分别为89%和85%）。5.0mu;M 噻苯隆处理使再生频率降低至47%（表1），仅在褐化叶片外植体上形成芽（图2D）。

这些数据表明，低浓度噻苯隆水平对促进两个杜鹃花基因型的嫩枝再生都是有效的。将AM中的浓度增加到5.0mu;MH，并使用液体脉冲处理，显示出这两个物种再生能力的基因型变化。对脉冲处理进行了测试，以尽量减少持续暴露于噻苯隆对芽形态的负面影响，这通常会导致芽状结构的过度氢化物、发育迟缓、筋膜化、变形和融合(Ahmad and Anis 2012)。脉冲处理可减少生长调节剂的暴露时间（Aasim et al.2010）。根据最近的报告，治疗时间可能从使用液体脉冲的几个小时到将PGR添加到再生介质的几天不等(Pascual and Marin 2005; Shaik et al. 2009;Graner et al. 2013)。实验结果表明，噻苯隆液体脉冲法处理降钙酶活性炭。酒红杜鹃叶片外植体诱导了较高的再生率，而西洋杜鹃没有发现这种效应。同时，脉冲处理并不能防止噻苯隆对酒红杜鹃幼苗形态的负面影响。需要进行深入研究以利用噻苯隆脉冲处理对杜鹃花的枝条再生进行研究。

表 2 酒红杜鹃叶片外植体的形态发生。（a）在添加0.5mu;m TDZ的条件下，35 d后叶片基部形成胚状结构和发育不全的异常芽。（b）经30mu;m TDZ脉冲处理后，AM0培养45 d时的短枝簇。（c）胚状结构（箭头）35 d时的短枝簇，外加5.0mu;m TDZ。（d）用5.0mu;m TDZ培养15周后褐叶外植体上的胚状结构（箭头）。（e）培养15周后，在0.5mu;m TDZ上发芽成簇

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