RNAi诱导FaDFR沉默对草莓（fragaria×ananassa）果实花青素代谢的影响外文翻译资料

 2023-01-07 10:01

RNAi诱导FaDFR沉默对草莓（fragariatimes;ananassa）果实花青素代谢的影响

摘要：二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）在花青素生物合成途径中将二氢黄酮醇转化为亮色色素。本研究以草莓（fragariatimes;ananassa）果实为材料，采用RTPCR方法克隆了FaDFR，其cDNA长度为1025bp，编码了340个氨基酸的预测蛋白。从FaDFR编码序列（cds）中扩增出的sense和anti-sense片段被用于构建包含RNAi沉默盒的植物表达载体pBI-DFRi。携带pBI-DFRi的农杆菌gv3101株在授粉后约14天仍然附着在植株上，在整个果实中均匀注入。注射后14天观察其表型，用半定量RT-PCR和高效液相色谱-质谱分析其果实。结果表明，与对照相比，农艺渗透果实的FaDFR下调，果实颜色变浅，并伴随着花青素浓度的变化。与对照组相比，PB1-DFRI渗透水果中的培拉根苷、花青素苷和山奈酚苷分别下降了93.3%、97.2%和55.6%，表明FADFR是草莓果实花青素生物合成途径中的关键基因之一。相比之下，槲皮素苷增加了73.1%，当花青素合成途径受阻时，代谢产物被分流到槲皮素苷生物合成途径。

1.介绍

栽培草莓（fragariatimes;ananassa duch.）是最受欢迎的商业水果之一，主要是因为它们的吸引力和营养价值。花青素色素使草莓果实呈红色，对人体健康也有好处，目前对模式植物和花卉花青素生物合成的生理机制进行了大量的研究，但其分子机制尚不清楚。de Almeida等人最近总结了草莓花青素代谢的相对完整的生物合成途径。（2007）（图1）。草莓花青素代谢途径以苯丙氨酸为起点，通过酶催化合成花青素、黄酮醇和黄酮-3-醇。草莓花青素主要有花青素3-葡萄糖苷、苦瓜苷3-葡萄糖苷、苦瓜苷3-芦丁苷、苦瓜苷丙二酰葡萄糖苷等。许多研究表明，无论哪一个品种，3-葡萄糖苷含量在草莓中最高，占58-93%。此外，花青素3-葡萄糖苷和葡萄糖苷3-芦丁苷在草莓中普遍存在（Bridle和Garcia Viguera，1997；Hong等人，1990；Bakker等人，1994）。草莓发育初期花青素含量很少，随着果实成熟，花青素含量迅速增加，与荔枝和葡萄的含量相同（肖等，2013；陈，2010；王等，2004；给定等，1988；伍德沃德，1972）。随着不同时期花青素含量的变化，花青素和黄酮-3-醇的含量呈下降趋势。草莓果实也会相应变化。产生这些代谢物的次级途径与常见的合成前体竞争。

图 1.花青素和黄酮类化合物的生物合成途径。PAL，苯丙氨酸氨裂合酶；c4h，肉桂酸4-羟化酶；4cl，p-香豆素连接酶；c3h，pcoumaroyl-coa3-羟化酶；chs，查尔酮合酶；chi，查尔酮异构酶；f3h，黄酮酮3-羟化酶；f3h，黄酮类3-羟化酶；fs，黄酮类合酶；dfr，二氢黄酮醇4-还原酶；ans，花青素合酶；lar，亮氨酸花青素还原酶ANR，花青素还原酶；UFGT，类黄酮糖基转移酶。

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）在花色素苷生物合成途径中将二氢黄酮醇转化为白色素苷，是桃和油桃果皮中花色素苷生物合成的关键酶（周，2009；Tsuda等，2004），调节DFR的表达可以改变日本香芹的花色。Y，烟草和矮牵牛（Huang和Ma，2012；Hasegawa等人，2001；Meyer等人，1987）。然而，对苹果和荔枝的研究却不尽相同。苹果果实在发育阶段有很高的DFR酶活性，而没有花青素的积累（Ju等人，1997）。荔枝果实中的DFR酶活性随着花青素积累的增加而降低，用花青素生物合成调节剂处理对DFR酶活性无明显影响（Wang等，2004）。DFR基因在不同植物物种中有不同的表达途径，因此其在花青素合成过程中的作用有待进一步研究。RNAi技术是一种分子技术，通过特异性地降低基因表达来研究体内各种酶的功能。由双链RNA（dsRNA）传递启动的植物基因RNAi是研究基因功能的一种有吸引力的新的反向遗传学工具（Waterhouse和Helliwell，2003）。RNAi现在经常被科学家使用，因为它比传统的拆卸技术有很多优势（Hamilton和Baulcombe，1999年）。据认为，RNAi最初可能是通过特异性地抑制靶基因的活性来对抗外来寄生核酸序列和功能的防御机制。沉默诱导的dsRNA可以通过稳定地转化具有编码“发夹”RNA（hpna）或病毒RNA结构的植物来传递，也可以通过用转基因农杆菌肿瘤浸润植物细胞来短暂传递，或者通过用病毒感染植物来传递（Burch-Smith等人，2004；Orzaez等人Al.，2006年；Robertson，2004年）。与传统的研究不同基因功能的方法相比，该方法提供了一种快速而精确的方法（Hoffmann等人，2006）。2006年，Hoffmann等人首次成功诱导利用RNAi技术对草莓CHS基因进行沉默，验证了该技术在果实中的可行性，为草莓果实花青素的生物合成机制提供了新的信息。然而，它们的矢量构造方法相当复杂。江等人。（2012）利用载体pbi121构建了一个更简单的无内含子的faf3h基因RNAi基因表达载体，该方法被证明更有效。f3h调控花青素代谢途径的前部，其表达不仅影响花青素，而且影响合成前体。但DFR与花青素的合成密切相关。f3h和DFR在调控不同代谢分支的花青素生物合成途径中可能具有不同的功能。在本研究中，我们构建了花青素合成酶基因DFR的RNAi载体，并将其注入到cv的果实中。“白化”草莓（fragariatimes;ananassa）的功能研究。结合代谢产物和酶活性分析，验证了DFR在分子水平上的作用，为草莓花青素生物合成机理提供了新的信息，并探讨了花青素含量对草莓果实作为重要功能性食品生产的理论依据。以及相关的类黄酮化合物。

2.材料和方法

2.1植物材料

白日中性八倍体草莓花香times;安纳萨。“白化病”用于输血。植物在中国农业大学的温室中进行常规种植和管理。用于提取RNA的果实于2011年3月收获。含有RNAi载体或对照载体的农杆菌gv3101的细胞是授粉后14天注入草莓果实。注射后14天收获果实。立即将所有样品切成碎片，冷冻在液氮中，并在-80℃下储存，直至使用。

2.2.RNA分离和RT-PCR分析

用RNA提取试剂盒（中国北京生物医学院植物RNA快速提取试剂盒离心柱）从样品中提取总RNA，在提供的缓冲液中在室温下培养15分钟，用不含RNase的DNA酶I（日本志贺大津Takara Bio）降解基因组DNA。用琼脂糖凝胶电泳和A260/A230和A260/A280比色计测定总RNA的纯度和完整性。根据制造商的指示，将1.2g总RNA样品与oligo（DT15）引物和MLV逆转录酶结合，使用m-mlv-rtase cDNA合成试剂盒（Promega，Madison，Wi-USA）进行第一链cDNA合成。

2.3.克隆FaDFR编码序列

从第一链cDNA中扩增出f a DFR的cds（编码序列），用一对引物DFR-f和DFR-r（本文所涉及的所有引物序列见表1）从cv的草莓DFR mRNA序列中设计。“伊利萨女王”（genbank登录号：AY695812）。采用Sanger方法对BGI公司的DNA进行测序。

2.4.FaDFR的sense和anti-sense的克隆

用两对引物对f a DFR（s）-f和一个附加的xbai限制位点、一个附加的bamhi限制位点的DFR（s）-r和一个附加的saci限制位点的DFR（a）-f、一个附加的bamhi限制位点的DFR（a）-r和一个根据cv序列设计的fadhi限制位点对f a DFR（s）和反义（a）片段进行PCR扩增。“白化病”FaDFR CD。

2.5. pBI-DFRi矢量构造

将FaDFR的感觉片段以正向插入到表达载体pbi121中，并用xbai和bamhi对其进行双消化鉴定。然后将FADFR反义片段反向插入，并用XBAI和SCAI双消化法鉴定其结构。这个沉默载体被命名为pBI-DFRi，当在体内转录时，将被预测形成一个DFR发夹结构（图2）。

图 2.PBI DFRI矢量构造。（a）所用的pbi-dfri结构包含35s启动子和nos终止子序列；前端插入DFR感测片段，后端插入反感测片段。（b）由RNAi载体在体内转录形成的发夹RNA结构。茎的长度约为321 bp。

2.6.农业渗透和转染

在这一过程中使用了pBI-DFRi矢量，用于转染，并用GV3101 carrying PB-121使用了一些水果。在Hosffmann等人（2005年）中，农业渗入和灌木接种疫苗接种的目的是降低产妇死亡率。（2006年）和刘等人（2006年）。（2009年）。

2.7.半定量分析

用qrt-pcr扩增引物semi-DFR-f和semi-DFR-r分别从对照品总RNA（1.2g）和pBI-DFRi渗入水果中合成的cDNA中检测DFR基因的相对转录水平。用肌动蛋白特异性引物actin-f和actin-r作为内对照，用一个编码恒定表达水平的细胞骨架肌动蛋白的草莓cDNA序列。

2.8.代数分析

本发明提供了一种控制或pBI-DFRi渗透率，分析了14天后注射后的果实。超人被过滤

通过一种有机膜和用于代谢分析的方法。高性能液相色谱色谱法紫外电喷雾离子喷雾电离质谱分析（HPLC-UVIES-MS）分析Bruke EsQuire 3 000 plus mass频谱（Bruke，BREMENT，Germany）与Agilent 1100 hplc System混合一年的1100季普基和1 100变量WavelEnth Detector（Agilent，W）在这方面，委员会注意到，《公约》第二条第1款规定，《公约》第四条第1款规定：（2012年）。根据MassLINXX V4.0（Waters）分析了质谱法。（Mullen等人，2003年；Matchaacute;- Riiinen等人，2003年，2004年；Seeram等人，2006年；Lopea-Da-Silva等人，2002年；Haninevs等人，2008年；Sirgigioti等人，2009年）。HP1100系列高性能变色色谱定量分析方法，以施泰恩等人为例。（2004年）。在350毫克/葡糖苷中检测了卡普费尔和克雷塞丁，这是用于定量化的标准的，在280毫微米的范围内，是一种内部标准。

2.9.酶活性测定

酶提取物提取物已经过时的预方法（Murray等人，1991年；Wang等人，2004年；Chen，2010年）。在布拉德福德方法中确定了总蛋白含量。本发明的酶活性是由陈的方法（2010年）进行的。

3.结果

3.1.克隆FaDFR

CD从草莓（fragariatimes;ananassa）的果实中分离得到了FaDFR的编码序列。“阿尔比昂”。DNA测序表明，CDS的长度为1025 bp，编码了340个氨基酸的预测蛋白，与草莓cv序列同源性为99.81%。“伊利萨女王”。草莓品种的FaDFR序列。“Albion”已提交给GeneBank（GenBank登记号：JX134094.1）。放大的FADFR CdS DNA片段的琼脂糖凝胶电泳，如图3所示。

图 3.DFR特异PCR的琼脂糖凝胶电泳泳道1:DL2000尺寸

标记；第2道：FADFR CD

3.2.FaDFR的sense和anti-sense片段的克隆

用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了DFR的特异性和抗特异性片段。预计长度分别为783 bp和321 bp。琼脂糖凝胶电泳测定的实际片段长度与预测长度一致。

3.3. pBI-DFRi沉默载体的构建及农业渗透

将FaDFR-sense片段插入到表达载体pbi-121中，用xbai和bamhi进行消化确认。碎片大小符合预期（图4a）。然后将反义片段插入携带该片段的PBI-121质粒中。用xbai和saci消化证实了pBI-DFRi载体的身份。总计根据预期，插入的RNAi盒的长度为1104 bp（图4b）。DNA测序证实了pbi-DFRi载体的成功构建。

图 4消声器矢量的构建（a）限制酶的消化酶与插入DFR感应片段的PBI121向量消化。LANE 1 : DL2000 SIZE Maraker；LANE 2 : DNA片段由 Xai 和 BamahDiana解析 . 标记带的长度显示在右侧。Xbai/Bamhi片段的预期大小为783 bp。。（b）限制酶的消化酶的消化。LANE 1 : DL2000 SIZE Maraker；LAN

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