细胞色素P450 CYP94B3介导植物激素茉莉酰-l-异亮氨酸的分解代谢和失活外文翻译资料

 2023-03-28 11:03

细胞色素P450 CYP94B3介导植物激素茉莉酰-l-异亮氨酸的分解代谢和失活

原文作者：Koo Abraham J K;Cooke Thomas F;Howe Gregg A

单位：密歇根州立大学能源植物研究实验室

摘要：植物激素茉莉酰-l-异亮氨酸（JA-Ile）通过COI1-JAZ辅受体复合物的信号，控制植物生长、发育和免疫功能的关键方面。尽管目前对于JA-Ile生物合成途径已经有了详细的了解，但对JA-Ile分解代谢和失活的遗传基础认识却知之甚少。在此，我们报道了一个来自拟南芥的创伤和茉莉酸反应基因的鉴定，该基因编码细胞色素P450 （CYP94B3）参与JA-Ile转换。通过对受损叶片的代谢分析表明，CYP94B3突变体的CYP94B3功能缺失会导致JA-Ile的过度积累和12-羟基-JA-Ile （12OH-JA-Ile）含量的减少，而该酶的过表达会导致JA-Ile的严重缺失和相应的12OH-JA-Ile水平的变化。体外研究表明，异型表达的CYP94B3可将JA-Ile转化为12OH-JA-Ile，且12OH-JA-Ile在促进COI1-JAZ受体复合物形成方面不如JA-Ile有效。因此，过表达CYP94B3的植物表现出表明JA-Ile缺失的表型，包括雄性发育缺陷、对茉莉酸诱导的生长抑制的抗性和对昆虫攻击的敏感性。受损CYP94B3叶片中JA-Ile积累的增加与茉莉酸响应基因表达的增强有关。这些结果表明，CYP94B3对JA-Ile水平具有负反馈调控作用，并在抑制茉莉酸反应中发挥关键作用。

关键词：植物防御；茉莉酸受体；茉莉酸；植物与昆虫相互作用；脂肪酸羟化酶

脂肪酸衍生物——茉莉酸在调节植物生长、繁殖和生物胁迫反应中起着重要作用。大量遗传和生化证据表明茉莉酰-l-异亮氨酸（JA-Ile）是该激素的一种受体活性形式[1-4]。结构研究支持了这一结论：JA-Ile的茉莉酸（JA）和部分异亮氨酸在细胞内COI1-JAZ受体复合物的组装中起关键作用，其中JAZ阻遏物被E3连接酶SCFCOI1靶向泛素化[5]。26S蛋白酶体降解JAZ抑制物可激活各种参与茉莉酸反应的基因的全基因组转录[1-4]。JA-Ile在启动该信号通路中的中心作用强调了理解JA-Ile内稳态相关细胞过程的重要性。

JA-Ile在协调植物受到伤害和昆虫攻击的防御反应方面具有良好的特性[6,7]。在拟南芥花环中，机械性组织损伤会引起JA-Ile水平局部和系统性的快速增加、JAZ抑制因子的降解和基因表达的激活[8-12]。创伤诱导JA-Ile积累的短暂性意味着存在着从受刺激细胞中灭活或移除JA-Ile的机制。在参与激素分解代谢的途径中，JA和JA- Ile分别转化为相应的12-羟基衍生物（12OH-JAs）、12OHJA（也称为结节酸）和12OH-JA-Ile[11,13-15]。其中，12OH-JAs可以进一步代谢为硫醚和葡萄糖衍生物，这些衍生物在促进典型的茉莉酸反应方面基本上是无效的[13,16,17]。然而，12OH-JAs具有诱导某些生理反应的能力，包括块茎形成和叶片闭合，这增加了这些化合物独立于COI1-JAZ受体系统的可能性[17,18]。

尽管12OH-JAs具有重要的生物学特性且在植物界广泛存在，但与JA和JA- Ile的12-羟基化有关的酶尚未被报道。在这里，我们确定JA-Ile-12-羟化酶是细胞色素P450单加氧酶（P450s）CYP94家族的成员（CYP94B3）。利用遗传、生化和代谢方法进行的功能研究表明，CYP94B3在茉莉酸反应的JA-Ile转换和衰减中发挥作用。因此，这些发现揭示了一种以前未探索的酶，它在茉莉酸代谢和信号转导中发挥关键作用。

1 结论

1.1 CYP94B3编码一种JA-Ile-12-羟化酶。我们使用两个通用标准来确定编码JA-Ile-12-羟化酶的候选基因。首先，P450在小分子羟基化和植物激素失活中的突出作用表明它们可能参与12OH-JAs的合成。由于12OH-JAs在脂肪酸酰化JA部分的omega;位置被羟基化（图1A），我们将注意力集中在P450的CYP86和CYP94家族成员上，这些成员在脂肪酸omega;-羟基化中起到了重要作用（图1B）[19-21]。其次，基于创伤反应期间底物（JA/JA-Ile）和产物（12OH-JAs）积累的动力学[11,13]，我们推断，编码参与JA-Ile转换的酶的基因可能是由创伤诱导的。通过对公开的基因表达数据的挖掘，我们能将候选基因列表细化为三个CYP94基因，它们的表达在创伤和JA治疗中强烈诱导：CYP94B1（At5g63450）、CYP94B3（At3g48520）和CYP94C1（At2g27690）。RNA印迹实验证实，这三个基因的表达都是创伤诱导的，与JA生物合成基因OPR3共同调控，并依赖于COI1（图1C）。与先前表明COI1途径促进JA-Ile转化的研究一致[23]，我们发现COI1-1突变体的受损叶片积累的JA-Ile水平高于野生型植物的叶片，12OH-JA-Ile水平低于野生型植物的叶片（图S1）。

为了测试选定的CYP94是否影响植物体内的JA-Ile-12-羟化酶活性，我们确定了创伤诱导的JA-Ile和12OH-JA-Ile在不能表达CYP94的T-DNA插入突变体叶片中的积累模式。在野生型植株中，JA-Ile水平在伤后30分钟内迅速上升，在1小时达到峰值，在随后的时间点逐渐下降（图2A）。经过约30分钟的滞后期后，12OH-JA-Ile逐渐累积并在剩余时间内稳定增加（图2A）。cyp94b1和cyp94c1株系中的JA-Ile和12OH-JA-Ile含量与野生型植株中的含量没有显著差异（图S3）。而受损伤的cyp94b3-1叶片中产生的JA-Ile量是野生型叶片的3-4倍。JA-Ile的大量增加伴随着12O-JA-Ile水平的大幅下降（lt;10%野生型水平）（图2 A、B）。在CYP94B3（图S3）中含有独立T-DNA插入（cyp94b3-2）的细胞系也获得了类似的结果。

我们使用额外的突变体进一步测试CYP94B3在JA-Ile分解代谢中的作用。过表达CYP94B3的转基因系（CYP94B3-OE）的受伤叶片的JA-Ile严重缺失（图2 A和B）。这些植物中的12OH-JA-Ile含量在受伤后的早期时间点（30分钟）升高，但在随后的（4小时）时间点，与野生型相比有所降低。类似于cyp94b3突变体，jar1突变体的损伤叶片中含有极低水平的12OH-JA-Ile。然而，与cyp94b3植物中增加的JA-Ile含量相比，受损的jar1叶片产生的JA-Ile含量却非常低（图2B）。这些发现与创伤诱导的12OH-JA-Ile的产生依赖于JAR1和CYP94B3的协同作用的途径一致（图1A）。

我们在酵母（酿酒酵母）中表达CYP94B3，用以直接测试其作为JA-Ile-12-羟化酶的功能。用空载体（pYeDP60）或CYP94B3 ORF转化的酵母细胞制备的微粒体部分与JA-Ile一起培养，并通过LC-MS/MS对反应产物进行分析。来自CYP94B3表达细胞的微粒体产生少量但可检测到的12OH-JA-Ile（图2C）。在含有空白载体（含有对照细胞）的微粒体的反应中，未产生12OH-JA-Ile，因此表明CYP94B3具有JA-Ile-12-羟化酶活性。

1.2 CYP94B3的异位表达再现JA缺陷的表型。我们观察到25个独立的CYP94B3-OE T1株系中有4个株系出现角果异常发育和结实减少的现象（表S1）。这种育性缺陷与T1群体中的受损叶片中JA-Ile水平的降低和12OH-JA-Ile含量的增加密切相关（图S4），并且在后代中也是可遗传的（图3A）。这些受影响的CYP94B3-OE株系的花发育时，花柱的柱头延长、花丝短、花粉活力降低（图3 B、C）。这些生殖表型是典型的拟南芥突变体，这些突变体再合成或感知JA方面存在缺陷[2]。

接下来，我们使用纯合的CYP94B3-OE株系来确定CYP94B3的过度表达是否会影响营养组织中茉莉酸反应。CYP94B3-OE幼苗的根系对JA诱导的生长抑制具有高度抗性（图3D）。CYP94B3-OE根系表现出的JA钝性水平略低于coi1-1幼苗（图S5），表明CYP94B3过度表达降低但不消除对外源JA的反应。CYP94B3-OE幼苗对细菌毒素冠状腺素（图3E）的反应性不受影响，冠状腺素是JA-Ile受体的一种强效激动剂[5,24]。这些结果表明，CYP94B3-OE植物对JA的敏感性降低是由于JA-Ile转换增加，而不是激素感知或信号传导的缺陷所致。

在添加JA的培养基上长时间（18天）生长的CYP94B3-OE幼苗的叶片也表现出较强的抗JA表型，包括JA诱导的褪绿和生长发育迟缓（图3F）。为了确定CYP94B3的异位表达是否会影响叶片的抗虫防御反应，我们比较了多功能食草动物甜菜夜蛾在成年野生型和转基因植物上的表现。在CYP94B3-OE植物上饲养8天或14天的昆虫比在野生型植株上生长的昆虫重得多（Plt;0.0001）（图3G）。转基因品系上生长的幼虫体重增加与CYP94B3-OE叶片受损程度以及受损叶片组织中JA-Ile水平降低相关（图S6）。与这些结果一致的是，机械损伤的CYP94B3-OE叶片中JA应答转录物的积累水平低于野生型叶片（图S7A）。

1.3 CYP94B3负向调节创伤诱导的基因表达。CYP94B3-OE植物的JA不敏感表型表明，CYP94B3可能在野生型植物中发挥作用，抑制由胁迫诱导的JA合成激活的茉莉酸反应。为了验证这一假设，我们比较了野生型和cyp94b3植物在创伤诱导下的几种主要反应基因的表达模式，这些基因会因JA-Ile水平的增加而迅速激活[8,9]。我们观察到cyp94b31对JAZ8和JAZ10的转录水平有显著影响，在受伤后1-5小时内，JAZ8和JAZ10转录水平在突变体中过度积累（相对于野生型）（图4A）。在此期间，JAZ8和JAZ10的表达增加与在同一组织中测得的JA-Ile含量增加相关（图4B）。这两个独立的实验证明，在创伤反应的后期，与野生型叶片相比，cyp94b3叶片中JAZ7、JAZ8和JAZ10 mRNA的水平更高（图S7）。

1.4 12OH-JA-Ile在促进COI1-JAZ相互作用方面不如JA-Ile活跃。为了研究12OH-JA-Ile的信号传导潜能，我们利用体外拉下实验比较了12OH-JA-Ile和JA-Ile促进COI1和JAZ蛋白相互作用的能力。JA-Ile以剂量依赖性的方式刺激COI1与全长JAZ3 （JAZ3.1）的结合，且在浓度为1mu;M时具有明显的刺激作用。12OH-JA-Ile也促进了COI1-JAZ3.1的相互作用，但在测试的浓度范围内，其活性显著低于JA-Ile（图5A）。在进行COI1和全长JAZ10 （JAZ10.1）的下拉试验中也得到了类似的结果（图5B）。

2 讨论

阐明调控JA-Ile稳态的细胞过程对理解这种激素介导的发育和防御相关过程至关重要。在这里，我们发现CYP94B3是一种JA-Ile-12羟化酶，它确定了JA-Ile分解代谢的主要途径。受损的cyp94b3叶片中JA-Ile的过量产生表明，该途径作为一个负反馈回路，有效地抑制了JA-Ile的积累。创伤诱导的12OH-JA-Ile积累的时间滞后（约30分钟），而JA-Ile在叶片受损后立即积累[8,11,25]，这与我们的体内和体外数据一致，表明JA-Ile是CYP94B3的底物。未受损的野生型和CYP94B3- QE叶片中缺少12OH-JA-Ile可能反映了这些组织中缺少CYP94B3底物（JA-Ile）。鉴于创伤诱导的CYP94B3表达，在创伤反应期间CYP94B3活性也可能上调。

CYP94B3在JA-Ile产生的负反馈控制中的关键作用得到以下事实的支持：CYP94B3的表达受到COI1的正调控，因此，受损的COI1会导致JA-Ile过度积累。coi1叶片中CYP94B3丰度低，预计会减缓JA-Ile向12OH-JA-Ile的转化，从而使JA-Ile积累。这一解释与研究表明烟草和番茄的coi1突变体也会由于JA-Ile周转减少而过度积累JA-Ile的结果一致[23]。然而，coi1植株产生大量12OH-J

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