低浓度淀粉样蛋白对sh-sy5y的蛋白质组学研究外文翻译资料

 2022-01-26 09:01

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摘要：蛋白质组学变化在许多神经元退化性疾病，包括阿尔兹海默症（AD）中都有发现。但是，早期病理发作的事件尚未完全阐明。伴随着重组形式的Abeta;42，内含将LAN5神经母细胞瘤细胞培养一小段时间的细胞模型系统被利用起来了。从这些中提取的蛋白质通过LTQ-Orbitrap-MS被用于对细胞进行鸟枪蛋白质组学分析，然后进行无标记定量。通过生物信息学工具我们显著地发现了上调的是与细胞骨架动力学（rho相关）和膜相关过程相关的部分。最重要的下调的蛋白质与hnRNP相关。特别是hnRNP参与核糖体生物合成和剪接的研究均下调。这些过程中的后一个非常突出，因为它被普遍强调，并且在每个分析的结果中具有最高的意义。而且，我们的研究结果显示，在剪接过程的每个阶段都会出现下调。通过下调剪接体的每个亚基。使用Western印迹也证实了剪接体的失调。总之，这些数据表明在Abeta;积累后鉴定为AD发病机制中的早期事件的蛋白质和过程失调。

关键词：鸟枪蛋白质组学，阿尔茨海默病，AD早期事件，剪接体

简介

阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症，其患病率随着年龄的增长呈指数增长。 AD患者逐渐失去认知功能，控制他们的定向感，情绪和其他方面的行为。现在认为有3500万人受到AD的影响，预计这一数字在未来几十年内会翻倍。因此，由于照顾这种疾病的患者的直接和间接成本，AD现在被认为是非常严重的公共卫生问题。病理组织学上，AD的特征是在扩散和神经炎斑块中存在beta;淀粉样蛋白（Abeta;）的细胞外沉积物，神经原纤维变化导致神经原纤维缠结，营养不良神经突和神经纤维网中过度磷酸化tau蛋白的细胞内沉积。通过淀粉样蛋白-beta;肽（Abeta;）的病理沉积产生淀粉样斑块。这种小蛋白来自beta;位点APP切割酶1（BACE1）和gamma;-分泌酶的顺序蛋白水解切割淀粉样蛋白前体蛋白（APP），gamma;-分泌酶是由早老素1和2等蛋白质组成的多亚基蛋白酶复合物（PS1，PS2） ）.迄今为止，针对这些经典标志物的疗法并不令人满意，目前只有姑息性治疗可供患者使用。需要进一步了解AD发病机制以开发有效的治疗方法。

在AD中，对淀粉样蛋白和tau的研究提供了关于致病机制的广泛知识，例如氧化应激，线粒体功能障碍，炎症和细胞凋亡; 然而，该疾病的潜在病因仍未完全了解。据信AD的病理生理过程始于诊断AD痴呆多年前的长期“临床前”阶段.在该疾病的这个阶段的治疗干预可能是非常有益的;然而，了解病理级联的启动与疾病的生物标志物之间的联系是必要的，以实现这种可能性。这项研究的一个主要障碍是区分年龄相关的认知障碍患者和临床前AD患者.在一项关于轻度认知障碍（MCI）患者的研究中，仅发现23％的病例转变为痴呆。可以根据明确定义的脑区中Tau神经原纤维缠结和Abeta;淀粉样沉积物的存在和水平来确定AD进展。在此基础上，AD被分为6个Braak分期（I-VI）.1-10 Braak分期I和II的特征是大脑的膈上区域仅存在少量神经原纤维变化，并且没有认知衰退的迹象已关联的。然而，在这些初始阶段，逐渐导致痴呆症的细胞功能障碍开始。

Abeta;的累积被认为是AD最早的病理组织学特征.因此，更深入地了解这种蛋白质对神经细胞的积累的直接和直接影响可能会揭示早期临床前所涉及的机制。疾病的阶段。此外，体外研究表明，通过使用重组Abeta;42，有可能再现分子和细胞功能障碍，导致AD发病和进展期间发生的信号级联，氧化应激，炎症，线粒体功能障碍和细胞凋亡的改变。 抗氧化剂和抗炎分子的共同给药可抑制重组Abeta;42诱导的所有细胞功能障碍，并可预防神经变性.同样，在体内简单模型系统中给予重组Abeta;42可再现退化过程中发生的细胞功能障碍。与前一个模型一样，可以通过使用抗氧化剂和抗炎分子来抑制这种情况.因此，建立正确的实验条件，可以模拟不同AD阶段发生的功能障碍。

在过去二十年中，蛋白质组学作为研究领域的发展使得能够比较疾病和正常条件下的蛋白质组谱，并因此可以鉴定新的疾病生物标志物和治疗靶标。例如，蛋白质组学方法已被成功应用于识别潜在的生物标志物，以区分血清和脑脊液（CSF）中的AD，PD患者和对照受试者.

本研究的目的是确定早期AD中涉及的潜在生物标志物。为此，我们采用了LTQ-Orbitrap质谱仪（LC-MS / MS）的鸟枪蛋白质组学方法。这种方法使我们能够比较轻微暴露于重组Abeta;42的LAN5神经母细胞瘤细胞的蛋白质组与对照细胞。质谱数据的生物信息学分析突出了处理细胞中各种过程和途径的失调。基因本体论（GO）分析表明，与RNA代谢相关的过程，染色体结构和细胞骨架结构，Rho相关和膜相关过程，特别是由Abeta;调节。途径富集分析显示，这些过程涉及的途径中，剪接体的途径是最显着的改变。 RNA剪接是将前体信使核糖核酸（前mRNA）转化为成熟mRNA以用于蛋白质翻译的必需细胞过程。 RNA加工允许从相同的转录物产生多种蛋白质同种型，从而增加遗传异质性。选择性剪接的变化与神经变性有关，包括在AD中。我们的研究结果表明，融合子失调可能在Abeta;的早期发病机制中对Abeta;的毒性作用起关键作用。

实验步骤

Abeta;42低聚物的制备和表征

根据参考文献12-14，以寡聚体形式产生，纯化和制备重组Abeta;42（Abeta;42）。简而言之，将单体形式的Abeta;42溶于pH7.2的0.01M Tris-HCl中。在37℃温育60分钟后，通过动态光散射（DLS）表征等分试样并连续加载到非变性PAGE和考马斯上。这里，作为较大物种的约25kDa的Abeta;42小聚集体的混合物被称为低聚物。

细胞培养和治疗

神经母细胞瘤LAN5细胞系用作细胞模型。该细胞系表现出神经元特征，包括神经丝的表达和短神经突的展示。用补充有10％胎牛血清（FBS）（GIBCO），2mM L-谷氨酰胺（SIGMA）和1％抗生素（50mg / mL-1青霉素和50mg / mL）的RPMI 1640培养基（CELBIO）培养细胞。 -1链霉素）（SIGMA）。将细胞维持在37plusmn;0.1℃的潮湿的5％CO 2气氛中。为了确定用于蛋白质组学实验的Abeta;42浓度，将LAN5（5times;106 / ml）细胞与不同浓度（20,40,60mu;M）的Abeta;42寡聚体一起温育1小时。在这些处理之后，LAN5细胞通过显微镜检查进行MTS测定和形态学分析（Zeiss Axio Scope用相机Axiocam）。基于这些结果，选择40mu;M的浓度用于制备实验。对于Western印迹实验，用20,40和60mu;M的Abeta;42处理LAN5细胞，用20和40mu;M处理15,60和120分钟，或用4mM的H2O2或1mu;M的阿霉素处理15,60和120分钟。根据Albert等人22和Picone等人23的浓度使用多柔比星和H2O2。

细胞活力的测定

通过MTS测定法（Promega Italia，S.r.1，Milan，Italy）测量细胞活力。根据制造商的说明书使用MTS [3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基 - 甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑]。细胞处理后，向各孔中加入20mu;LMTS溶液，在37℃，5％CO 2下继续培养4小时。在Microplate读数器WallacVictor 2 1420 Multilabel Counter（PerkinElmer，Inc.，Monza，Italy）上在490nm处读取吸光度。结果表示为对照细胞的MTS减少百分比。

总蛋白质提取和蛋白质印迹

通过溶解在增溶缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.4,150mM NaCl，0.5％Triton X-100,2mM PMSF，1mM DTT，0.1％SDS与蛋白酶抑制剂，Amersham和磷酸酶抑制剂混合物中）制备总蛋白质。 II，Sigma），LAN5细胞未经处理或如上所述进行处理。通过10％SDS-PAGE凝胶分离蛋白质样品（50mu;g）并转移到硝酸纤维素滤膜上用于使用抗GSK3alpha;/beta;（1：1000），抗磷酸化GSK3beta;（1：1000），抗SmB / B#39;进行蛋白质印迹。购自Sigma Cruz的抗-NPP6（1：500），抗MAPP1（1：500），抗MAPK1（1：1000），购自Sigma的抗beta;-肌动蛋白（1：10000）。根据制造商的说明书，使用NOVEX ECL HRP化学发光试剂盒（目录号WP20005，Invitrogen）检测从Cell Signaling购买的与辣根过氧化物酶（1：2000）缀合的二抗。用凝胶记录系统（BioRad）分析条带强度，并用beta;-肌动蛋白表达标准化表达。通过密度计量化蛋白质水平并表示为相对于对照的百分比。使用从上述两个不同实验中提取的蛋白质将蛋白质印迹重复三次。

实验设计

将LAN5细胞在四个单独的烧瓶中培养。 将两个烧瓶用于Abeta;42（40mu;M）处理，并且两个烧瓶未经处理。 每个烧瓶用于两次技术重复。另一组实验的蛋白质印迹验证了一些蛋白质的表达。

含有识别和定量数据的数据集已存放在PRIDE / ProteomeXchange24中，数据集标识符PXD002842和项目DOI：10.6019 / PXD002842。

用于质谱的蛋白质提取物的制备

使用Thermomixer comfort（Eppendorf，Hamburg，Germany）将蛋白质制剂与1％SDS在100mM Tris-HCl（pH8.8），100mM DTT中，在95℃和500rpm下孵育5分钟。将提取物离心，并将含蛋白质的上清液通过4-20％TGX凝胶（Bio-Rad）进行1-DE分离，以检查蛋白质提取物的质量。然后使用BCA定量试剂盒（Pierce，Rockford，IL，现在是Thermo Scientific的一部分）对样品进行定量。

过滤辅助样品制备和过滤消化

用UA溶液（8M尿素在100mM Tris-HCl中，pH8.8）将SDS蛋白质提取物稀释至200mu;L，装入Amicon过滤装置，10kDa截止值（Millipore，现为Merck Millipore，Billerica，MA），然后加工根据“FASP II”协议（14,15,16）。将样品以14000g离心15分钟，并将浓缩物用200mu;LUA溶液稀释到过滤器中并再次离心。离心后，将浓缩物与100mu;L10mMDTT的UA溶液混合，并在25℃下孵育30分钟。离心后，将浓缩物与100mu;L50mMIAM的UA溶液混合，并在20℃温育20分钟。离心后，将浓缩物用100mu;LUA溶液稀释并再次浓缩（该步骤重复两次）。接下来，将浓缩物用100mu;L的50mM ABC稀释并再次浓缩。该步骤重复一次。随后，将40mu;L胰蛋白酶溶液（150ng，在50mM ABC中）加入到过滤器中，并将样品在37℃下孵育过夜。通过离心过滤器单元收集肽，然后用含有70％乙腈和1％甲酸的溶液再洗涤50mu;L。最后，将肽混合物干燥并在0.2％甲酸中重构至终浓度为1mg / mL。通过BCA定量方法（Pierce）定量肽提取物。

LC-MS / MS分析

使用与UltiMate 3000 RSLCnano LC系统（Thermo Scientific）接口的LTQ-Orbitrap Velos质谱仪（Thermo Scientific）进行LC-MS / MS分析。加载后，将肽混合物（每次运行4mu;g）浓缩并在捕获预柱（Acclaim PepMapC18,75mu;mtimes;2cm nanoViper，3mu;m，100mu;，Thermo Scientific）上使用0.2％甲酸脱盐，流速为5mu;L/ min。使用C18柱（Acclaim PepMap RSLCC18,75mu;mtimes;15cm nanoViper，2mu;m，100mu;，Thermo Scientific）以300nL / min的流速在35℃下进行肽分离，使用485min梯度在洗脱液A中的1至50％洗脱液B（0.2％甲酸在95％ACN中）（在5％ACN中的0.2％甲酸）。质谱仪LTQ-Orbitrap Velos在Xcalibur软件（版本1.0.2.65 SP2）的直接控制下以数据相关的MS / MS模式设置，其中遵循全扫描光谱（从300到1,700 m / z）通过串联质谱（MS / MS）。仪器以正模式操作，喷射电压为1.2 kV，毛细管温度为275°C，并在测量前进行校准 -

发言：在Orbitrap中进行全扫描，分辨率为30000,400m / z，自动增益控制设定为1000000离子，并且在质子化的聚二甲基环硅氧烷背景离子（（Si（CH3）2O）6上启用锁定质量选项; m / z = 445.120025）作为精确质量测量的内部重新校准.25选择肽离子作为前一次扫描的10个最强峰（前10个）。触发MS / MS事件的信号阈值设置为500计数。通过对归一化碰撞能量应用40％的值，m / z 3.0的隔离宽度，0.25的aq值，选择在C阱的远侧执行的更高能量碰撞解离（HCD）作为碎裂方法，并且激活时间为0.1毫秒。使用氮气作为碰撞气体。

数据分析

Proteome Discoverer平台（版本1.3; Thermo Scientific，Bremen，Germany）与内部Mascot服务器（版本2.3，Matrix Science，London，UK）连接，用于数据解析和蛋白质鉴定，根据以下标准： Homo sapiens，数据库UniProtKB / Swiss-Prot（2012_05版），参赛人数为20272，酶胰蛋白酶，最大遗漏切割位点2，分类学智人，前体质量耐受性10 ppm，片段质量耐受性0.02 Da，半胱氨酸氨甲酰甲基化为静态修饰，N-末端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸和甲硫氨酸氧化作为动态修饰。 Percolator算法用于肽验证（肽置信度：q值lt;0.01），26并且仅考虑1级肽。根据Proteome Discoverer的算法允许使用肽和蛋白质分组，应用严格的最大简约原则。使用基于光谱计数（SpC）值的无标记量化作为半定量测量来评估蛋白质丰度并比较不同样品中相同蛋白质的表达，如前所述.27,28 SpC对数比（RSC）为用来表示不同

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