纳米二氧化钛缓解四环素对拟南芥毒性的研究外文翻译资料

 2022-01-27 10:01

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纳米二氧化钛缓解四环素对拟南芥毒性的研究

【摘要】以暴露在四环素(TC)和二氧化钛纳米颗粒(TiO2 NPs)下的拟南芥（L.）为研究对象，研究了其生物化学和分子反应。结果表明，与对照相比，1 mg/L TC显著降低了拟南芥生物量33.3%；然而，与单独处理TC相比，50 mg/L和100 mg/L TiO2 NPs的存在减轻了TC的毒性，分别增加了45%和28%的生物量。TC的存在显著降低了根系和芽的Ti积累。拟南芥幼苗和根系的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)等抗氧化酶活性表明，TC显著提高了活性氧(ROS)清除剂的活性。然而，在共暴露处理中，TiO2 NPs使抗氧化酶活性降低到控制水平。分别测定了硫同化基因和谷胱甘肽生物合成途径基因在芽和根中的相对表达量。有趣的是，三种处理(单独处理TC、单独处理TiO2 NPs和单独处理TCtimes;TiO2 NPs)根中腺苷转移酶(APT)、腺苷-5 #39; -磷酸硫酸盐还原酶(APR)和亚硫酸盐还原酶(SiR)的相对表达均比对照高2 - 3.5倍。TiO2NPs或TC处理的拟南芥增加了 gamma;-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)及谷胱甘肽合成酶(GS)的表达。在检测时，与对照相比，TC单独处理的POD减少了近93%；然而，与单独处理相比，TiO2 NPs使共暴露植株的POD增加了300%。这些发现为了解植物系统中金属基纳米颗粒与抗生素等共污染物的相互作用提供了重要信息。

【关键词】拟南芥，二氧化钛纳米粒子，四环素，共污染，分子反应，作物品质

  1. 前言

抗生素已广泛应用于农业和畜牧业，以促进生长和预防疾病。大多数抗生素是水溶性的，牲畜不易吸收；大约40% - 90%的抗生素是通过尿液或粪便排出的。在美国，每年大约使用了51吨抗生素，其中，在牲畜饲养中使用了将近79%的抗生素(相当于1354万公斤)。同样，在中国，每年大约生产21万吨抗生素，四分之三以上用于畜牧业。抗生素可以从制药废物、废水处理设施和畜牧业中释放到环境中。由于土壤和水体被认为是环境污染物的主要汇聚处，抗生素对微生物、植物和动物群落的不利影响引起了人们的关注。

在欧盟，如果抗生素的环境浓度超过10mu;g /公斤,进一步的评估应进行具体的化合物。TC和TC衍生品的浓度估计可能在450minus;900mu;g /公斤，这高于欧盟监管45minus;90倍。因此，有必要研究TC对陆生植物的毒性以及环境中出现的其他污染物。磺胺类药物(SA)和四环素(TC)由于对微生物、原生动物和其他寄生虫种群具有广泛的抑制作用，是应用最广泛的抗生素。一旦抗生素被排放到环境中，植物很可能会积累土壤中的残留物。事实上，目前大量的研究集中在陆生植物对抗生素的吸收上。最近的一项研究表明，包括黄瓜、番茄和生菜在内的常见的蔬菜作物，在不同浓度(0 - 20 mg/kg)的环境中生长45天，可以在不同的植物组织中积累SA和TC。另外，Topal等人发现南芦苇中TC及其降解产物的浓度从根到叶显著降低。此外，TC及其降解产物的相对积累情况如下：4-差向四环素gt;四环素gt;4-差向脱水四环素gt;脱水四环素。在105 mg/kg氧四环素的土壤土中对大豆进行盆栽试验，结果表明，抗生素仅在根中积累，在芽中没有明显的易位现象。抗生素的种类也会明显影响植物的吸收水平。例如，50 mg/L暴露下的ox- TC和TC在处理水稻15天的根浓度因子(RCFasymp;2100)相似，而氯-TC在11天的根浓度因子(RCF约2700)明显较高。Pan等人认为抗生素沿着食物链在生物体内不应被忽视,但也指出,浓度(TC 2100mu;g)在蔬菜作物都明显低于最低治疗剂量(20-200毫克)。重要的是，文献中很少有关于植物毒性和反应基础的力学研究，因此，对这些过程的了解仍然不够。

工程纳米材料（ENMs）在农业、食品制造、生物医药、电子、可再生能源等领域的应用日益广泛。二氧化钛(TiO2)是一种常用的纳米粒子(NPs);每年生产超过3000吨二氧化钛NPs，其中一半以上用于个人护理产品。在农业中，ENMs可用于检测病原体，更有效地运送农药和化肥，并监测土壤条件。尽管ENMs对农作物有积极的影响，但由于其纳米尺寸，可能会给农业系统带来潜在的风险。近年来的实验室研究表明，ENMs的存在会导致根系伸长抑制、生物量下降、光合效率低下、发育迟缓和未知后果的独特分子效应。近年来，Ma等人对植物暴露于不同类型的金属基NMs时的防御机制进行了综述。陆生植物抗氧化酶活性在纳米颗粒诱导的植物毒性解毒中起着重要作用。此外，在分子水平上的研究也为了解植物中与压力相关的基因对纳米颗粒暴露的反应提供了线索。鉴于农业系统的复杂性，与金属氧化物纳米颗粒和抗生素等药物化合物共暴露的可能性相当高；然而，这方面的工作做得很少。在本研究中，我们选择了拟南芥(L.)为目标植物，以TiO2NPs和TC经水培处理。为了全面了解共混污染物对作物产量的影响及其防御机制，研究了拟南芥对TiO2 NPs和TC共暴露的生理和分子反应。测定了其对生物量、Ti吸收、叶绿素含量、蛋白质含量和POD形成的影响。此外，还测定了不同处理条件下拟南芥幼苗和根系主要活性氧(ROS)清除剂的活性，包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化物酶(POD)。在分子水平上，对拟南芥的根和茎的硫同化相关基因、谷胱甘肽生物合成相关基因、应激相关基因的相对表达进行了分析。据我们所知，这是关于金属基NPs在减轻抗生素对植物毒性方面的作用的第一份报告。我们的发现提供了关于抗生素和金属基NPs对农作物产量和质量的潜在风险的重要信息，如果这些对拟南芥的影响可以转化为对真正农作物的影响。

  1. 材料和方法

2.1实验设计

浓度的优化，二氧化钛纳米粒子(TiO2 NPs)购自美国研究纳米材料公司。TiO2 NPs的尺寸在5 ~ 15nm之间，TiO2 NPs的形态为金红石。四环素(ge;98%)来源于Sigma-Aldrich公司。将25颗经表面消毒的哥伦比亚野生型拟南芥 (Col-0)种子置于半强度(1/2times;) MS半固体培养基上，用不同浓度的TiO2 NPs (0 ~ 500 mg/L)处理。同样，在经过不同浓度TC (0 - 5 mg/L)修饰的1/2times;MS半固态培养基中培养无菌种子。种子在4℃下放置24小时，然后分别在22摄氏度和8℃转移到光照16小时和黑暗8小时的受控植物生长室。在收获时，用新鲜总生物量测定TiO2NPs和TC的毒性;结果如图S1所示。

2.2水培系统

拟南芥在蛭石中生长21天，移栽到如图S2所示的水培体系中，让幼苗适应5天。通过上述浓度优化试验，确定了水培体系中TiO2和TC的用量。如图S1A所示，较低浓度的TiO2 NPs (50 mg/L)显著促进植物生长；100 mg/L TiO2 NPs时差异无统计学意义；随着TiO2NPs浓度增加到200 mg/L，新鲜生物量大大减少。因此，我们选择了这三种TiO2 NPs (50mg /L、100mg /L和200mg /L)的暴露量进行水培实验。在水培实验中，采用相同的方法确定合适的TC浓度。在1 mg/L和5 mg/L之前，TC暴露对新鲜生物量没有影响，与对照相比，新鲜生物量分别减少了21.7%和59.6%(图S1B)。所选择的三种TC剂量分别为1、5和10 mg/L。总共有16个处理(表S1)，包括9个不同的共暴露处理，每个TiO2 NPs和TC暴露有3个单一的分析物对照，1个对照只使用1/2倍霍格兰溶液。每个处理中有6个重复。拟南芥幼苗在不同浓度的TiO2NPs和TC下培养12天。收获时，用去离子水彻底冲洗根三次，测定根长和总新鲜生物量。植物组织保存在- 80℃，待进一步分析。

2.3叶绿素含量

根据Lichtenthaler等人的描述，测定了拟南芥中总叶绿素的含量。取50毫克的新鲜叶子快速地切成碎片（小于1厘米）；然后用10毫升95%的乙醇提取总叶绿素。所有样品都在黑暗中保存了3天，以避免叶绿素降解。在664.2和648.6纳米处用紫外分光光度计测量了吸收度。叶绿素a、叶绿素B和总叶绿素由以下方程式计算：

chla=13.36 A664.2minus;5.19A648.6(1)，

chlb=27.43 A648.6minus;8.12 A664 2(2)，

总叶绿素=chla chlb(3)。

2.4维生素和营养元素含量

拟南芥的芽和根分别冻干，然后磨成细粉。在硫酸（H2SO4）和过氧化氢（H2O2）中，大约有50毫克的芽组织或10毫克的根组织在稍作修改的情况下，按照Short等人（1996年）和Wei等人（2015年）描述的方法被消化。详细资料载于辅助资料。采用电感耦合等离子体光学发射光谱法对样品进行了测量。

2.5蛋白质总含量

采用布拉福德试剂测定植物组织中蛋白质的总含量。在2毫升的三氯甲烷溶液（ph.7.2）中提取了50毫克的三氯甲烷根芽或根样本。然后将混合物在2683g处离心20分钟，在4℃处离心。100微升的上清液在室温下与1000mu;l的布拉德福德试剂反应15分钟，然后用紫外分光光度计测量595nm的吸收度。

2.6抗氧化酶分析

新鲜的根和芽组织在液氮中均质化成细粉。然后用涡旋混合器将0.5克均匀组织样品与5毫升的萃取缓冲液大力混合5分钟。混合物在4℃2683g离心20分钟，上清液被用于测量抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶。每种抗氧化酶法的修正规程在支持信息中提供。

2.7定量逆转录聚合酶链反应的基因表达测量

在RNA分离前，在液氮中分别分离出芽和根组织。他们按照QRT-PCR的规章描述了全RNA分离、cDNA合成和基因表达。简单地说，用RNeasy plant mini试剂盒分离总RNA，用NanoDrop分光光度法(ThermoScientific, West Palm Beach, FL)定量。采用Verso cDNA合成试剂盒合成cDNA，利用primer Quest (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)设计基因特异性引物。表S2提供了引物序列的完整列表。QTR-PCR扩增程序的信息可在支持信息中找到。相对量(2minus;Delta;Delta;Ct方法)被用来计算每个基因的转录水平。

2.8统计分析

采用单因素方差分析和邓肯多重比较检验确定除了QRT-PCR检测以外的各处理间各参数的统计学意义，采用t检验确定各基因的统计学意义。在各试验图中，ple;0.05时，数值随字母的变化有显著性差异。

  1. 讨论与结果

3.1TiO2NPs和TC对拟南芥生长的影响

从图1A和图S3中可以看出，不同浓度的TiO2 NPs对植株生长影响不显著。与对照组相比，虽然1 mg/ L TC对生长有负作用(图1A)，但TiO2 NPs的存在似乎明显减轻了TC的植物毒性。在收获时，测量根系长度和总新鲜生物量(图1B和C)。根长在10 mg/L TC照射下显著缩短；共暴露处理除1 mg/L TCtimes;100和200 mg/L TiO2 NPs处理外，其余均无明显差异；在这两种情况下，与TC对照相比，根长分别减少了22%和17%。与对照组相比，三种单TC处理的总新鲜生物量减少了约30%。添加50 mg/L和100 mg/L TiO2 NPs明显减轻了拟南芥的植物毒性，使经1mg /L TC处理的拟南芥鲜生物量恢复到对照组水平(图1C)。这一结果表明，TiO2 NPs可以在较低的抗生素剂量下抵消TC对拟南芥的毒性。当TC浓度增加到5 mg/L和10 mg/L时，虽然新鲜生物量有增加的趋势，但结果无统计学意义。一种可能的解释是TiO2NPs与植物外部的TC相互作用，防止了在微米或纳米级的暴露，但当TC的暴露剂量达到1 mg/L时，这一过程是饱和的。

图1：TiO2NPs和TC对拟南芥的生理作用。(A)与TiO2 NPs和TC共暴露的拟南芥图像；(B)根长度；(C)总新鲜生物量。数据为5 ~ 6次重复的平均值plusmn;标准误差。各参数值后接不同字母表示数据点在ple;0.05时差异显著。

3.2TiO2NPs和TC对拟南芥的吸收和营养元素含量的影响

采用TiOlt;

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