纯物理吸附：用不同孔径介孔二氧化硅固定化纤维素酶外文翻译资料

 2022-02-13 18:58:47

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纯物理吸附：用不同孔径介孔二氧化硅固定化纤维素酶

摘要

为探讨纤维素酶吸附过程的物理机理，本研究采用纯物理吸附的方法，在不同孔径的介孔二氧化硅中固定了产自支顶孢属菌的纤维素酶。采用种子生长法合成了孔径为17.6nm和3.8nm的介孔二氧化硅材料(以下分别称为MS-17.6nm和MS-3.8nm)。其他可用的介孔二氧化硅(H-32)和硅藻土也被用作吸附剂。然后用小角x射线散射(SAXS)、透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)、巴雷特-埃米特-特勒(BET)法和布雷特-乔伊纳-哈拉达(BJH)法对吸附剂进行了表征，确定了它们的介观结构。此外，研究了不同吸附剂的吸附能力和固定化纤维素酶的酶活性。吸附量与吸附剂的孔径有明显的相关性。也就是，孔径与纤维素酶分子长轴相似的MS-17.6nm (410 mg/g)的吸附量高于孔径接近纤维素酶短轴的MS-3.8nm (315 mg/g)的吸附量(50℃时)。此外，由于硅藻土的孔径明显大于纤维素酶分子，其吸附行为(孔径约为200 nm)呈现周期性。同时，孔径大小是影响纤维素酶活性的重要因素。当MS-3.8nm的平均孔径刚好与纤维素酶分子短轴相匹配时，固定化纤维素酶完好地保留了纤维素酶的活性位点，表现出最佳活性(即50℃时游离纤维素酶活性的63.3%)。因此，吸附剂的孔径对纤维素酶的固定化有显著影响。

简介

利用可再生生物质生产燃料能源已被认为是解决化石燃料枯竭和环境污染问题的一种战略途径。木质纤维素生物质，如林业和农业废弃物，是最有前途的生物质能源之一。纤维素是木质纤维素生物质的主要成分，由1,4 -糖苷键连接的葡萄糖单元组成。由于纤维素是水解产物，葡萄糖容易转化为乙醇、丁醇等燃料和精细化学品，研究人员对纤维素转化为葡萄糖的途径进行了深入研究。然而，物理和化学过程通常需要极端的处理，例如对高压、高温或强酸的要求。这些方法往往是能源密集型的，并可能产生不良的副产品。相反，酶促纤维素转化通常在相对温和、特异性高的反应条件下进行，被认为是一种替代的“绿色”方法。

纤维素酶是一组水解纤维素的酶的总称，由于其在将纤维素生物质转化为葡萄糖方面的重要作用，纤维素酶在这一“绿色”途径中得到了深入的研究。因此，降低酶的成本是降低纤维素生物燃料生产成本的关键因素之一。由于游离纤维素酶稳定性较差，不能有效回收和再利用，如果能解决这些问题，有可能降低酶水解的成本，克服这些问题，研究了固定化方法、超滤体系、水两相体系和纤维素酶改性。这些报道表明，固定化纤维素酶可能是提高酶利用效率的一种有前途的方法。

在过去的20年中，人们对纤维素酶在无机材料上的固定化进行了广泛的研究。不幸的是，固定化纤维素酶在无机材料表面，如非晶态二氧化硅或磁性纳米颗粒，不能保持自由纤维素酶的全部活性。在这些无机材料中，介孔二氧化硅以其均匀的孔径、大的表面积和高的可达孔隙体积得到了广泛的应用，研究了其作为小分子药物、DNA和蛋白质载体的潜在应用。Chang等人合成了两种不同孔径和表面积的介孔二氧化硅，用于纤维素酶的物理吸附和化学结合。同时，优化了纤维素水解的反应条件，包括温度、时间和纤维素酶的用量。结果表明，纤维素酶与具有羧基的介孔二氧化硅发生化学连接，具有较大的孔径，能有效地将纤维素转化为葡萄糖，转化率超过80%，且具有良好的稳定性。

为了利用介孔二氧化硅制备出更合适的纤维素酶固定化方法，了解影响介孔二氧化硅中蛋白质固定化行为的因素具有重要意义。研究发现，有两个因素对固定化性能有较大影响。首先是介孔二氧化硅和蛋白质的表面特征。吸附剂的表面电荷与蛋白质必须是互补的，因为人们普遍认为蛋白质与介孔二氧化硅之间的静电相互作用是影响吸附和解吸的最重要因素之一。第二种是中孔的大小，更确切地说，是相对于蛋白质分子大小的孔隙大小。为了吸收纤维素酶，中间通道的孔径应该足够大，以便“舒适”地包裹生物分子。Kisler等人的研究表明，MCM-41材料的吸附量在很大程度上取决于吸附的分子大小相对于一系列生物分子的孔径。然而，Takimoto等人使用介孔二氧化硅SBA-15包裹纤维素酶分子，研究了固定化纤维素酶在不同孔径介孔二氧化硅上的酶活性。孔径为8.9 nm的SBA-15包裹纤维素酶的酶活性最高，但没有最大的孔径和最大的吸附量。在此，提出了一种新的理论对孔隙大小，不是更好的就越大，大的孔隙大小可能达到一个很好的初始吸附量，随着解吸和死亡操作稳定。与此同时，丰富的纤维素酶分子导致分子密集的排布，吸附将防止构象的灵活性，最终导致酶活性丧失。虽然有几篇关于介孔二氧化硅作为吸附剂对酶的物理吸附的报道，但是利用介孔二氧化硅对纤维素酶进行吸附还缺乏信息。

为了调查物理吸附过程的吸附机制，我们讨论了以下几个因素：合成两种不同孔隙大小的介孔二氧化硅，分别为17.6nm和3.8 nm （MS-17.6 nm和MS-3.8 nm的“MS”指介孔二氧化硅）。与此同时，一系列可用的、被表示为H-32和硅藻土的介孔二氧化硅也用作吸附剂。此外，还详细研究了不同吸附剂形态、固定温度和吸附剂用量对吸附量的影响。我们还研究了固定化纤维素酶在不同吸附剂上的酶活性。

实验

材料

所有化学品均为分析级，未经进一步净化使用。羧甲基纤维素钠(CMC,nacalai tesque)，醋酸钠(NaAc,,nacalai tesque)，醋酸(nacalai tesque)， 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB, nacalai tesque)，乙酸乙酯(EtAc, nacalai tesque)，硅酸钠元(nacalai tesque)，甲醇(nacalai tesque)，盐酸(nacalai tesque)，H-32(介孔二氧化硅、AGC有限公司)，硅藻土(华力有限公司)，GLU CⅡ（葡萄糖，日本和光纯药工业株式会社）和支顶孢属纤维素酶(明治精华制药有限公司)。整个实验过程中都使用去离子水。

介孔二氧化硅的合成

本实验采用种子生长法制备了介孔二氧化硅(MS-17.6 nm)。将5.0 g CTAB和6.0 g Na2O·SiO2溶于90 mL水溶液中，室温(25℃)，制得混合溶液。然后加入6.4 mL乙酸乙酯，搅拌5 min，室温静置6 h，在90℃油浴中搅拌48 h。然后，停止加热，悬浮体自然冷却到室温。最后离心收集产物，用酸性甲醇溶液(pH 1.4) ，用Soxhlet萃取器完全提取CTAB模板10h。

合成MS-3.8 方法如下。简而言之，将4.2 g CTAB和3.5 g Na2O·SiO2分别加入170ml水溶液中，室温搅拌30s。待溶液澄清后，加入3.2 mL乙酸乙酯。反应在80℃下进行48小时。将合成材料中的CTAB模板在550℃下加热3 h，去除模板后收集介孔二氧化硅。

纤维素酶在吸附剂上的固定化

纤维素酶在吸附剂上的固定化按以下步骤进行。在一个典型的吸附实验中，在纤维素酶溶液中加入一定量的吸附剂(纤维素酶100 mg, pH值5.0的10mm NaAc缓冲液25 mL)，盖在一个容器中防止蒸发。然后在给定的温度下搅拌24小时，以建立吸附平衡。用NaAc缓冲液洗涤3次，10000times;g离心10 min，收集吸附剂上的固定化纤维素酶。以血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定上清液中纤维素酶分子残留量。纤维素酶固定化的数量计算使用公式

(x/m)a=(Ci minus;Ce )times;Va/W，

(x/m)a是每单位重量的吸附剂(mgmgminus;1) 固定纤维素酶化数量, Ci是纤维素酶解中蛋白质的初始浓度(mgmLminus;1)，Ce是蛋白质的平衡浓度(mgmLminus;1)，Va是溶液体积(mL)，W是吸着剂的重量（mL）。

为研究吸附剂形态对固定化效果的影响，在4 mg/mL纤维素酶溶液25 mL中加入250 mg不同的吸附剂进行固定化。在50°C下搅拌24小时。然后，用紫外-可见分光光度法测定不同吸附剂对纤维素酶的固定化量。为研究温度对固定化效果的影响，在MS-17.6nm粉末(250 mg)中加入25 mL 4 mg/mL纤维素酶溶液。在50°C, 25°C和4°C 混合搅拌24 h。为了调查固定吸附量的影响，实验中纤维素酶吸附到MS-17.6 nm和MS-3.8 nm，实验一系列初始输入给定的吸着剂，从150mg到250mg的纤维素酶浓度。在50°C进行24 h。为了使纤维素酶浓度保持为一个常数，用100mg纤维素酶溶解在25mL缓冲液中。

纤维素的酶解

纤维素酶活性测定为纤维素降解后葡萄糖的释放量。200micro;L纤维素酶固定化的吸着剂 (含有0.5毫克纤维素酶)或纤维素酶 (2.5mg/mL)与200micro;L CMC溶液混合(2%)，然后在50°C培养30分钟。混合物沸腾5分钟停止水解反应。一个国际单位(IU)的纤维素酶活性被定义为CMC生产每分钟1micro;mol葡萄糖所用纤维素酶的数量。

水解后，以10000times;g离心10 min，去除固定化纤维素酶。然后使用上层清液通过GLU CⅡ工具包进行葡萄糖分析。

描述

用Micromeritics Tristar 3000分析仪在77k下测量氮气(N2)的吸附等温线，采用Barrett-Emmett-Teller方法计算表面积。用Brarrett-Joyner-Halanda方法从等温线的解吸支计算了孔隙体积和孔径分布。用紫外分光光度计在595 nm波长下测定溶液的紫外-可见光谱。小角x射线散射实验进行Kratky的小角系统，配备了位敏线探测器包含1024个频道宽度53.6micro;m。Serfert ID 3000 x射线发生器在50 kV和40 mA提供1.542 CuKalpha;辐射的波长。用透射电镜和扫描电镜对样品在100kv时的尺寸、形状和颗粒分布进行了分析。为此目的，将样品纳米粒子分散到碳包覆的铜网格上。

结果和讨论

物理吸附机理采用合成介孔二氧化硅MS-17.6nm和MS-3.8nm，工业材料H-32和硅藻土作为吸附剂。研究了吸附剂的形态、固定温度和添加量对吸附效果的影响。

介孔二氧化硅的表征

采用氮气吸附-脱附分析、小角x射线衍射、透射电镜和扫描电镜对不同介孔二氧化硅和有效多孔二氧化硅进行了形貌和结构表征。图1为MS-17.6nm和MS-3.8nm的小角度x射线散射图。可以看出MS-17.6nm的SAXS图形(图1a)表现出明显的(100)衍射峰，d间距为38.4 a，以及两个与二维六角形介结构(p6mm)相关的小峰(110)和(200)，证实了二氧化硅基体具有高度有序的介结构。对于MS-3.8nm, SAXS衍射峰为(100)，正如你所说，MS-3.8nm与MS-17.6nm具有相似的介结构。但是(100)峰的强度较弱，没有其他两个峰，说明MS-3.8nm的二维六边形结构是不完整的。这可能与合成过程中有机模板的低温稀溶液或短烃链有关。此外，MS-3.8nm的部分二维六角形结构可能被破坏。因此，MS-3.8nm比MS-17.6nm具有更少的有序介结构。

图2所示的透射电镜图像为介孔结构提供了进一步的证据，这些图像代表了用CTAB制备的介孔二氧化硅。透射电镜(TEM)图2c为MS-17.6nm，图中有一些d间距为36.9 a的弯曲晶格条纹，沿[001]方向观察到有序的介孔结构，说明介孔二氧化硅是一个高度有序的介孔结构。此外，从图2d可以直接观察到MS-3.8nm的孔隙和晶格条纹，孔径和d间距均为约38.2 A。同时可以清楚地看出MS-3.8nm是由片状二氧化硅堆积而成。两种结果分别与小角x射线衍射(XRD)计算的(100)晶面值吻合较好。图2a和图2 b中显示了介孔二氧化硅的粒度: MS- 17.6 nm(4 - 12mu;m)和MS- 3.8 nm(1-7mu;m)。此外，由脱附支测得的材料N2吸附等温线及其相应的孔径分布(BJH)如图3所示。图3显示，MS- 17.6 nm等温线在据IUPAC分类相对高的P/PO，具有Ⅳ型曲线与H1磁滞回线。表明了介孔结构。计算得到MS-17.6nm的比表面积为474.7 m2g-1，平均孔径为17.6nm，总孔隙体积为1.5 cm3g-1。用BJH方法分析的孔径分布如图所示，在17.6 nm处有一个尖峰。相比之下，MS-3.8nm的比表面积为105.2 m2g-1，平均孔径3.8 nm，总孔隙体积0.3cm3g-1。可以观察到典型的Ⅳ型曲线和H4观察磁滞回线,这表明介孔结构可能是由于片状二氧化硅的积累。这些情况与SAXS和TEM结果一致。

纤维素酶在不同吸附剂上的固定化

由于化学固定化极有可能占据纤维素酶的活性位点，导致纤维素酶很难改变构象，因此采用纯物理吸附法将纤维素酶固定在不同的吸附剂上，不需要任何化学键或共价键。纤维素酶的催化活性与其构象容易改变构象的方式固定化。然而，有许多因素切相关。为了获得良好的活性，纤维素酶必须以一对固定化至关重要，如吸附剂的形态、反应温度、吸附剂的量和反应时间。为了获得合适的固定化方法，使纤维素自由地改变构象，首先确定了吸附剂的形态对其影响。

形态学的影响

如图4所示，MS-17.6nm的吸附量最大，325.5 mg/g(纤维素酶/吸附剂)，接近1.2 mg/g，是MS-3.8nm吸附量的3倍。MS-3.8 nm、h -32和硅藻土在24 h后的吸附量分别为271.7 mg/g、301.0 mg/g和311.5 mg/g，略低于MS-17.6nm。在这些吸附剂中，硅藻土的吸附行为呈现出周期性，出乎意料的是，8 h时吸附量最大为320.0 mg/g,

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