油橄榄（Olea europaea L.）真菌对炭疽菌（Colletotrichum）的拮抗活性外文翻译资料

 2022-02-14 08:02

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油橄榄（Olea europaea L.）真菌对炭疽菌（Colletotrichum）的拮抗活性

摘要：鉴定了天然存在于橄榄树中的真菌，并测试了它们对抗茶炭疽病菌的拮抗潜力。共鉴定出14株分离株，其中12株属于链格孢属，附球菌属，镰孢〔霉〕属，曲霉属，节菱孢属， 毛壳（菌）属，间座壳属，黑孢子菌属，一株属于炭角菌科，一株未分类。所有真菌分离物在双重培养 生长期间对茶炭疽病菌的生长显示出一些抑制作用，然而，当进行琼脂扩散试验时，仅五种真菌分离物引起茶炭疽病菌生长抑制：青霉菌。分离2（26.8％），来自炭角菌科的真菌（14.3％），青霉菌。隔离1（10.7％）；喜树内生真菌（10.7％），黑孢子虫（3.5％）。通过气相色谱技术鉴定由这些分离物产生的挥发性物质， 如苯乙醇， 4- 甲基喹唑啉， 苯并噻唑， 苯甲醇， 铃兰醛， 加乐麝香等。这些抑制性挥发物可能在减少橄榄中的茶炭疽病菌膨胀方面发挥重要作用，并且他们的研究应该进一步探索潜在的生物防治剂。

关键词：炭疽病；生物防治；橄榄挥发物

1.介绍

炭疽菌属于子囊菌属真菌，含有一些最成功的植物病原真菌物 种，对广泛的木本和草本作物造成高度经济损失，尤其是全球热 带和温带地区的水果，蔬菜和观赏植物。

由于其科学和经济重要性，来自炭疽菌属的物种最近被列为十大真菌病原体。该属中最致病的物种之一是猕猴桃炭疽病菌，它会在橄榄，杏仁，桃，柑橘，草莓等重要宿主中引起炭疽病和枯萎病，可影响植物的大部分区域，症状范围从枝条和叶斑到果腐。水果的症状非常重要，因为它们造成的经济损失，而不是仅在田间（收获前），但也在贮藏期间（收获后）。

目前，针对炭疽病的最有效控制措施依赖于文化控制，使用抗性栽培品种，化学控制和/或使用拮抗生物的生物控制。文化控制措施对降低接种水平和加剧真菌最佳发育条件非常有帮助；然而，它们还不足以对抗茶炭疽病菌，它们应该被用作综合控制的一部分。此外， 抗性/耐受性品种并非适用于所有作物，与用抗性替代已建立的作物相关的成本非常高，并且生产者通常基于除抗病性之外的其他标准选 择栽培品种。因此，控制炭疽菌的最常见策略是使用化学杀菌剂。尽 管杀真菌剂降低了疾病的严重程度，但难以实现根除，并且通常需要 重复施用以维持保护。此外，在收获前需要遵守杀菌剂安全期，可能 会导致在橄榄炭疽病等疾病易感性极高的发育阶段对水果的保护不完全（卡乔拉等人，2012). 使用杀菌剂的负面影响是显而易见的；滥用化学化合物不利于人类健康，造成环境污染和抗真菌剂的病原体的发展。因此，生物控制具有重要意义。在过去的三十年中，人们越来越关注使用生物制剂控制真菌植物病原体，并且许多微生物已被确定为潜在的生物控制剂（阿拉伯维特 等人， 2006). 植物寄主是获得攻击这些寄主的病原体的良好拮抗剂的最佳场所。植物通常在其表面（附生植物）或内部组织（内生菌）中存在几种不会引起任何明显损伤的真菌。这些真菌非常多样化，它们的作用缺乏研究。关于潜在生物控制剂的类别，内生微生物已经获得了相当大的重要性。一些研究表明，内生真菌会产生抑制田间和贮藏中其他真菌生长的化合物

本研究的目的在于评估从橄榄中分离的几种真菌通过其拮抗活 性和次级代谢产物的作用来抑制植物病原真菌茶炭疽病菌的生长的能力。

2.材料和方法

2.1.病原体的分离

植物病原真菌茶炭疽病菌由地质学实验室，地中海农业与环境科学研究所（ICAAM）提供，它最初是从橄榄树cv的水果中分离出来的。生长在埃尔瓦什，葡萄牙的山羊豆属。

将茶炭疽病菌分离株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上，在 室温（25-28 ℃）下培养，并在4℃ ℃下贮存备用。

2.2.样品收集和真菌分离株的分离

从cv的50个无症状橄榄树中收集无症状叶子的样品。Galega vulgar来自位于葡萄牙南部（Eacute;vora）的果园。为了寻找附生植物 和内生菌，一半收集的叶子没有消毒，另一半通过70％（v / v） 乙醇处理2分钟，3％次氯酸钠处理3分钟，乙醇70％（v / v）1分钟，最后一次洗涤在无菌蒸馏水中重复三次， 每次1分钟（维尔马等人，2007). 将经处理和未经处理的叶子置于含有PDA的培养皿（9cm）上。将板在室温下温育7天（25plusmn;3 ℃）。

通过将菌丝体从生长的真菌菌落的边缘转移到含有新鲜PDA的单个培养皿（5cm）并在室温下孵育来进一步纯化真菌。（25plusmn;3℃）七天。

2.3.真菌鉴定

根据制造商的说明，使用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）从在PDA平板中生长的真菌培养物中提取DNA 7天。利用ITS1和ITS4引物从基因组DNA中PCR扩增核rDNA的内部转录间隔区（ITS）区域。

PCR反应由30-80 ng基因组DNA，10 mM Tris-HCl（pH 8.6），50 mM KCl，1.5 mM MgCl 2,0.2 mM dNTP组成，1uL 每种引物和 2.5uL DreamTaq DNA 聚合酶，总体积为50uL。扩增在热循环仪（Bio-Rad）中 于95 ℃下进行2分钟，然后进行通过40个循环的95 ℃持续30秒，50 ℃持续50秒，和72 ℃持续60秒， 最后延伸72 ℃持续10分钟。

使用GFX Gel DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，并通过Macrogen在正向和反向方向上测序。使 用生物编辑序列比对编辑器v.7.2.3进行ITS序列的序列分析. 使用国家生物技术信息中心和真菌条码网站上的基 本 局 部 比 对 搜 索 工 具 进 行 同 源 序 列 的 搜 索。

2.4.对抗性测试

2.4.1.直接抑制试验

使用直接对抗方法体外测试真菌分离物对茶炭疽病菌的拮抗活性（丹尼斯和 韦伯斯特，1971). 简而言之，将来自活跃生长的茶炭疽病菌菌落边缘的5mm菌丝体盘放置在离9cm PDA板壁约1cm处， 并在相对侧放置相似大小的真菌分离物盘。将平板在25℃ ◦温育， 并对每种测试的真菌使用三次重复。还使用单独的茶炭疽病菌进行对照试验。为了估计生长抑制百分比，用verner caliper测量每种分离的真菌和对照板的茶炭疽病菌的径向生长，并连续记录5 天和第7天，第10天和第15天。抑制百分比使用以下公式计算:

使用从A 到D 的标度评估两种真菌之间的相互作用类型: A = 茶炭疽病菌与相互作用真菌接触时的生长抑制；B = 茶炭疽病菌和相互作用的真菌的相互混合，但两者都以不同的速率缓慢生长；C =相互抑制，空间距离lt;0.2 cm；D =距离处的相互抑制gt; 0.2厘米。

对暴露于真菌分离物的茶炭疽病菌的边缘进行显微镜观察。将 它们安装在显微镜载玻片上并用乳酚蓝染色。一个非暴露的茶炭疽病菌用作对照。在显微镜下观察载玻片。

2.4.2.挥发性化合物测试

为了评估可能对茶炭疽病菌生长有一定活性的挥发性化合物的可能产生，进行了简单的试验。

将分离的真菌在PDA培养皿（9cm）上培养5天。在小（5cm）PDA平板中，将茶炭疽病菌培养48小时。在这些时期之后，将含有植 物病原真菌的小平板倒置在每个分离的真菌的顶部。顶部用封口膜和胶带密封，以防止挥发物扩散。将含有不同真菌的每个平板 中的茶炭疽病菌的生长与倒置在仅含有PDA培养基的平板中的对照进行比较。使用三次重复。

在25℃ 温育5天后，直径为50℃ plusmn;测量病原体菌落，并使用与前述相同的配方计算抑制百分比。

2.4.3.非挥发性化合物测试

每个含有 15 毫升马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）的Erlenmeyer烧瓶用5毫米菌丝体盘接种活跃生长的真菌分离菌落的边缘，并在25℃ ℃下孵育12天。在此之后，使用150mm（Whatmplusmn;an）滤纸过滤溶液以除去孢子和其他真菌结构。

将75ul，100ul和200ul不同培养物滤液置于1cm圆孔中，该孔 直接在相对侧的培养基中制备，其中茶炭疽病菌在9cm PDA平板中生长两天。使用每个过滤溶液的三个重复以及其中孔仅用75ulPBS 单独填充的对照。

2.5.挥发物的萃取和色谱分析

如前所述进行提取。简而言之，向10ml 管中加入8ml PDB，其中每种真菌生长并加入磁力搅拌棒（22.2mm 4.8mm）。使用3-辛醇作为内标。通过将样品与500ul二氯甲烷一起搅拌15分钟来进行萃取。在0℃ 冷却10分钟后，除去磁力搅拌棒，通过离心（2948g，5分钟，4℃）得到有机相，使用巴斯德吸管将提取物回收到小瓶中。然后用无水硫酸钠干燥芳族提取物并再次收集在新小瓶中。

热芬尼根微量气相色谱仪，配备Thermo Finnigan Polaris Q 250 ℃（保持10分钟）；使用以下柱温程序：Rtx-5（交叉键5%二苯基-95%双酯聚硅氧烷）30m，0.25mm内径和0.25um膜厚度（RESTEK，uSA）：40 ℃（保持1分钟）加热在5 ℃ / min至250 ℃（保持5分钟），然后在5 ℃ / min加热至300 ℃（保持1分钟）。

载气为流速（恒定流量）的氦气级1.0毫升/分钟；注射温度为250 ℃，采用不分流模式，分流量为50 ml / min。使用70eV的电离能和250 ℃的传输线温度，在全扫描模式下通过正离子电子轰击（EI）质谱法进行检测。

质量采集范围为m / z 30-450，扫描速率为3扫描minus;1。通过将它们的质谱与文献和商业文库NIST MS Search 2.0和Wiley 7中报道的那些进行比较来鉴定色谱峰。在所描述的两个柱中计算线性保留指数值。

对于每种化合物，将计算的线性保留指数与其他作者和NIST库报告的那些进行比较，以便有另一种工具来帮助鉴定化合物。一式两份分析所有样品。

2.6.统计分析

使用IBM SPSS统计软件包v.20，对每个时期的拮抗性真菌之间的差异进行方差分析（ANOVA）。当在数据集之间发现统计学差异 时，使用Tukey HSD测试进行多重平均比较（P lt;0.05）。

3.结果

从500棵欧洲橡胶树的消毒和未消毒的叶子中回收了总共14种不同的真菌分离物。来自位于葡萄牙的果园的Galega vulgar。

测序结果证实在未消毒的叶子中存在七种不同的真菌：链格孢属（青霉菌。）。隔离1；黑曲霉；黑附球（真）菌分离1 和分离2；镰刀菌隔离1；安氏金蝇。安氏金蝇科的一种真菌，不可能确定该物种；消毒叶片中有7种：青霉菌。隔离2；毛壳（菌）属 sp。；间座壳菌。；黑曲霉分离株3；镰刀菌隔离2；黑孢子虫（Neigrospora oryzae）和未终止的内生真菌。

大多数优势种是黑曲霉；交链孢菌和镰刀菌属，共检测到14种真菌中的7种。筛选所有14种真菌分离物对植物病原真菌茶炭疽病菌的拮抗活性。贯穿直接抑制试验的茶炭疽病菌的特点是持续增长（表4） 除了存在A.niger，N。oryzae和未分类的内生真菌（图2A和B）。A. niger图1左下）和未分类的内生真菌通过接触（相互作用类型A） 抑制茶炭疽病菌的生长， 而米曲霉（ 图。1 右上方） 抑制茶炭疽病菌的生长，空间距离小于0.2厘米（相互作用类型C）（表格1）。所有其他真菌分离物显示出一些相互抑制，它们的生长在拮抗剂和致病真菌之间的距离超过0.2厘米（相互作用类型D）（图1右下）。

对真菌分离株的抑制百分比范围为11.8％至86.3％（图3）， 表明所有真菌分离株对茶炭疽病菌的生长都有一些抑制作用。正如所发现的相互作用类型所预期的那样，黑曲霉，米曲霉和未分 类的内生菌是在直接抑制试验中表现出更强的抑制茶炭疽病菌生长能力的那些，百分比为86.3％，66.7％和68.6％ ， 分别。

茶炭疽病菌与拮抗真菌之间相互作用的显微观察未显示病原菌菌丝的任何改变（数据未显示）。

测试的所有14种真菌分离物产生挥发物，其对茶炭疽病菌的生长产生一些抑制。虽然分离株之间的差异不显着，但最有效的是青霉菌。分离2，E。龙葵分离3和镰刀霉菌。 分离2抑制生长48％，而间座壳菌的效果较差。和米曲霉占28％（图4；表5）。

至于琼脂扩散试验，只有5种真菌分离物，其中4种从消毒的叶子 中分离出来，产生的物质能够减少茶炭疽病菌的径向生长。

一些抑制值 ：黑假芝。分离2（26.8 ％），来自安氏金蝇科的真菌（14.3％），青霉菌。隔离 1（10.7％）；间座壳菌。（10.7％），米曲霉（3.5％）（图5）。

尽管只鉴定了少量挥发性化合物，但研究中的五个样品呈现出 一些不同的特征（表2）。 值得注意的是，青霉菌。的样本。就挥发性化合物而言，分离物1是最差的。一些化合物似乎是一些样品的特征，即安氏金蝇（4-甲基喹唑啉和苯并噻唑）和青霉菌。分离出2（苯甲醇）。除了青霉菌的样品外，所有样品中都含有苯乙醇。分离1，虽然浓度不同。在样品间座壳菌。和稻瘟病菌，它是最大的峰，而在安氏金蝇 样品中，峰面积非常小。尽管青霉菌。隔离1峰具有与间座壳菌中所示相似的相对面积。和米曲霉，有一个巨大的峰，显示碎片模式，可以归结为有机酸的酯，可能含有氟原子。

在所有测试的真菌样品中检测到吡嗪化合物和丙酸衍生物，两 个化学家族（表3).呈现典型的吡嗪化合物碎片离子的化合物m/z 154和m/z

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