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日期糖浆多酚对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性
摘 要
植物来源的产品如日期糖浆（DS）已经证明具有抗菌活性并且可以通过许多不同的机制抑制细菌，这可能归因于包括植物来源的酚类分子的生物活性化合物。DS含有丰富 的多酚，本研究假设DS多酚具有固有的抗菌活性，可引起氧化损伤。该调查显示DS含 有高含量的总多酚（605 mg / 100 g），富含单宁（357 mg / 100 g），黄酮类化合物（40.5 mg / 100 g）和黄烷醇（31.7 mg / 100 g）这是已知的强效抗氧化剂。此外，DS和从DS中提取的多酚，DS中最丰富的生物活性成分分别对革兰氏阳性和革兰氏阴性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌作用。进一步表明，提取的多酚可以独立地 抑制细菌的生长，大肠杆菌和金黄葡萄球菌的最大抑菌浓度（MIC）为30和20 mg / mL，并观察到DS通过产生过氧化氢而起到促氧化剂的作用，所述过氧化氢通过氧化应激导致细菌的生长抑制。在亚致死的MIC浓度下，DS通过还原过氧化物表现出抗氧化活性，在致死浓度下，DS表现出抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的促氧化活性。DS中天然存在的高糖含量没有显著影响这种效果。这些研究结果强调DS的抗菌活性是通过过氧化氢的产生来介导的，诱导细菌的氧化应激。
关键词：Phoenix dactylifera L.；日期糖浆；多酚；金黄色葡萄球菌
- 介绍
金黄色葡萄球菌属于慢性伤口，与慢性炎症有很强的相关性，导致高发病率（Orsi等.2002).此外，抗生素抗性细菌的增加对全世界的医疗保健构成威胁，导致植物产品作为辅助抗菌剂控制病原微生物的兴趣重新燃起（Cowan.1999).天然衍生的化合物，如芦荟，蜂蜜和姜黄素（De等.2009）作为替代抗菌化合物越来越受欢迎。用于传统医药应用的主要植物群是Phoenix Dactylifera L.，通常称为枣椰树。枣椰子的果实通常用于治疗肠道紊乱（Vyawahare.2009).在埃及，枣椰树花粉一直被用于提高生育能力(Al-Qarawi等.2003). 博扎 (2002）已经证明枣椰子仁包含在药用皮肤治疗中，并且已知中东的游牧部落使用传统 的日期糖浆（ DS ）作为伤口愈合的抗菌剂（ Tahraoui等.2007）。
诸如DS的日期产品在食品工业中用作甜味替代品以及用于饮料和酒精的生产（Aboubacar.2010). 对于日期衍生的药用混合物的消费和利用，感知的健康益处更多地归因于DS和枣果中发现的生物活性和营养化合物。 DS是酚类化合物的丰富来源，已知有效的自由基清除剂（Vayalil.2002），针对DS组成的各种研究已经确定了显着的抗氧化潜力（郭等.2003）这可能暗示了日期水果的科学基础和DS的传统医药应用。许多酚类化合物如多酚和类黄酮因 其氧化潜力而具有抗菌作用（Daglia.2012），这可能为日期水果和DS作为抗菌剂的医药应用提供理论依据。
虽然尚不清楚抗氧化剂清除潜力如何有助于DS的抑菌和杀菌活性。已知促氧化剂会导致微生物的生理化学和结构变化，从而导致生长迟缓（Halliwell.2008).
对这一概念的挑战是能够确定DS抑制微生物的作用方式，以及哪种生物活性化合物有助于这种作用。抗氧化剂作为活性氧物质（ROS）的强力清除剂的主题最近在应用食品微生物学，食品科学和技术以及细胞免疫学中获得了相当大的关注。次生代谢产物（如多酚）的抗氧化/促氧化活性可能取决于pH，金属还原电位，螯合活性和溶解度等因素（崎滨等.2002).多酚具有抗氧化活性（自由基清除和金属螯合活性）或促氧化活性，取决于环境条件，相互作用结构变化和微生物作用（Yordi等.2012).多酚能够在利用氧化还原活性金属如铁和铜的系统中充当促氧化剂。多酚配合物与Fe3 结合，该配合物能够还原（Fe）2 被氧化成半醌，并能够进一步还原Fe3 ，将半醌氧化成醌。Fe3 的还原产生Fe2 ，因此参与Fenton反应并导致ROS产生。
细菌有氧呼吸产生细胞能量产生所需的氧气（O2）（Macvanin和Hughes, 2010).呼吸过程中微生物对O2 的不完全还原产生ROS，包括过氧化氢（H2O2）和羟基（OHminus;）。有氧的细菌呼吸防御与ROS积累相关的氧化应激，例如通过几种机制暴露于多酚，其中一种机制是产生过氧化氢酶和超氧化物歧化酶， 它们可以对抗ROS 。超氧化物歧化酶将OHminus; 还原为H2O2，过氧化氢酶因此将H2O2转化为水和O2。ROS的解毒过程是有效的并且在细胞内H2O2 浓度控制在稳态值。
在大肠杆菌中0.2mu;M（Brudzynski等.2011).抗氧化剂如多酚和类黄酮通过增加ROS和H2O2 的产生诱导细菌裂解。鉴于已知DS具有各种生物活性多酚，据报道为潜在的抗菌剂，本研究旨在确定DS对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的 抑菌和杀菌活性，并确定该活性是否受（a）DS植物化学物质的影响。化合物，即多酚，（b）细菌对由多酚产生和介导的过氧化氢引起的氧化应激的敏感性，和（c）糖含量的渗透压不是导致抗菌活性的主要因素。
- 材料和方法
2.1 标准品，溶剂和试剂
以下试剂获自Sigma（Sigma-Aldrich，UK）：XAD-2树脂， Folin-Ciocalteu试剂，丁基化羟基芴（BHT），聚乙烯基聚 吡咯烷酮（ PVPP ） ， 没食子酸和儿茶素。丙酮和甲醇（HPLC级），二甲酚橙，氯化铝， 从 Fisher Scientific（UK）获得葡萄糖，果糖和蔗糖（分析级）和过氧化氢。从Merck(Darmstadt,Germany)购买2,21 - 二苯基-1-苦基肼（DPPH）
2.2 日期糖浆抗菌测试准备
日期糖浆来自在2012-2013的潮湿季节的水果品种Khadrawi，属于Arecaceae，凤凰属和dactylifera种。DS原始且未经 处理;在收到后存储在4◦C。DS是未消毒的，不能立即适用于抗菌药敏试验。因此，采用不同的灭菌方法来确定哪种方法对DS最理想，对DS的成分影响最小。使用溶剂丙酮对DS进行灭菌被确定为最合适的。将200g DS充分混合并在室温下在200mL丙酮（分析级）中浸泡48小时。48小时后，将均匀混合物通过Whatman No.1滤纸过滤，并在40◦C下在旋转蒸发（Bibby RE-100，Bibby Scientific）蒸发溶剂，以确保除去所有丙酮。将粗DS提取物在营养肉汤（NB）培养基中 再水化并通过0.22mu;m过滤器（Millex-GV，Millipore，UK） 并储存在-80◦C用于分析，最终浓度为50mg / mL DS。
2.3 人工DS的制备
对DS中存在的糖进行高效液相色谱（HPLC）分析，以确定单个糖成分的百分比。通过混合4.79g蔗糖（总量的7.6％）制备人造DS，每份100g在无菌去离子水中加入29.05g果糖（总量的46.13％）和29.13g葡萄糖（总量的46.3％），并在50℃的水浴中加热10分钟以确保糖的完全溶解。
2.4 XAD-2树脂中DS类黄酮和酚类成分的提取
将日期糖浆（50g）与250mL pH2 HCl溶液混合24小时;将混合物通过棉绒过滤以除去未溶解的固体颗粒。首先将XAD-2树脂（约47g）在2M HCl中调节1小时，通过浸泡在1：1甲醇和水中进行预溶胀过夜。将具有树脂的浆料装入玻璃柱（50cm3）中，除去溶液，使床体积约为150cm3，并用1L去离子水冲洗。
将过滤的DS溶液缓慢通过填充的树脂柱，然后加入250mL酸化水（pH2），去离子水（300mL），最后用300mL纯甲醇洗脱酚类馏分。将50mL收集的甲醇提取物在40℃真空下浓缩至干燥，重新溶于水并储存在-80◦C进行分析，然后将剩余的甲醇提取物储存在-80℃◦，并相应地溶解用于抗菌分析。
2.5 抗氧化活性的测定
2.5.1 总酚含量测定
DS的总酚含量通过Folin-Ciocalteu比色测定法测定，基于先前鉴定的方法测定(Al-Farsi等,2005).使用没食子酸作为分光光度标准品（0-100mg / mL）,结果表示为每100gDSplusmn;5mg的没食子酸当量（GAE）为SDmg。测量一式三份进行总黄酮含量通过氯化铝比色测定法测量(智深等,1999).相对于空白对照，在510nm处测量吸光度。总黄酮含量表示为mg GAE / 100g DS。
2.5.2 黄烷醇总含量
总黄酮醇含量改编自下述方法Jimoh 等,2010); 将200 mu;l DS（25 mg/mL）与250 mu;l 2％AlCl3 和250 mu;l 5％乙酸钠溶液混合。将混合物密封并在室温下温育2.5小时。在440nm处测量吸光度，结果表示为每100g DS（mg儿茶素/100g DS）的儿茶素当量mg。
2.5.3 总单宁含量
在通过吸附到不溶性基质PVPP 上除去单宁后， 通过Folin-Ciocalteu 方法测定总单宁含量。这种方法是基于(Hagerman等,2000）和(Kchaou等,2013);将1mL DS提取物（25mg / mL）加入到100mg PVPP中，并在4℃◦C下温育15分钟。将混合物剧烈摇动并以13,000g离心15分钟，收集上清液并对未吸附的酚类物质进行Folin-Ciocalteu测定以获得总酚含量。从总酚含量中减去结果，总单宁 以mg GAE / 100g鲜重表示。
2.5.4 总类胡萝卜素含量
根据Talcott和Howard（1999）的方法提取总类胡萝卜素，在红光下工作，在黑暗条件下使用以下等式计算总类胡萝卜素，并表示为mg / 100g DS：
总类胡萝卜素= [(OD)(V)(106)/(A1％)(100)(W)]
其中OD = 470nm处的吸光度，V =样品提取物的体积，A1％=1％的类胡萝卜素混合物在2500的平均消光系数，W =样品重量（g）
2.5.5 总花青素含量
根据Giusti和Wrolstad（2001）描述的pH-差异方法测定和计算总花色素苷。 总花青素含量表示为mg / 100g DS，并根据以下两个等式计算：
(1) 两种花色素苷提取物的吸光度差异通过以下公式计算：
/J.A =（OD510 pH1.0-OD700 pH1.0）- (OD510 pH4.5-OD700 pH4.5）
(2) 原始样品中的单体花青素色素浓度表示为氰化3-葡萄糖苷当量，并基于下式计算：
[(OA)(MW)(DF)(V)(100)/(ε)(L)(W)]
其中氰化物3-葡萄糖苷的分子量（449.2 g / mol），DF稀释因子，V终体积（mL），ε摩尔消光系数（氰化物3-葡萄糖苷）（26,900），L细胞通道长度1 cm，W样品重量（g）
2.6 评估抗氧化活性
DPPH自由基清除活性基于稳定自由基DPPH的清除活性评估DS的抗自由基清除能力。简言之，将溶解在去离子水中的100mu;l不同DS浓度（5-50mg /mL）等分到96孔板（Costar）中，加入50mu;l超纯（ELGA）水， 然后加入50mu;l400mu;m的400mu;l DPPH（在无水乙醇中）。将板密封并振荡5分钟，随后在室温下避光温育25分钟。用空白溶液在490nm处用分光光度法测量吸光度。将市售的抗氧化剂BHT用作阳性对照(10mg / mL,在乙醇中），并且基于下式计算抑制百分比活性并表示为％抗氧化活性：
[OD1 - OD2/ OD1100]
其中OD1 是空白对照的吸光度，OD2 是样品提取物的吸光度。
2.7 抗菌药敏试验
细菌菌株在整个研究中使用大肠杆菌（参考菌株NCTC 10418）和金黄色葡萄球菌（参考菌株NCTC 13142）。培养物在NB（Fluka） 中37℃有氧培养24小时，以促进浮游生长。
2.7.1 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）
使用肉汤 - 微量稀释法和分光光度法测定DS和提取的DS多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度（MIC）。根据临床和实验室标准研究所[CLSI]（2012）的方法，在无菌96孔圆底聚苯乙烯微量滴定板（Corning Costar Ltd，New York，NY，USA）中测定MIC，通过连续稀释测定MIC（5-） 50 mg / mL，增量为5 mg / mL）。在每种浓度的测试样品中加入对应于0.5McFarland预培养标准的细菌接种物[在37℃下16小时，相当于106个菌落形成单位（CFU）]。一式三份测 量样品。将平板在37℃◦ 温育24 小时， 并在平板读数器（SPECTROstar Nano，BMG Labtech）中以650nm分光光度法测量浊度。根据临床和实验室 标准协会[CLSI](2012）标准评估MBC，其中针对上述MIC描述的那些孔显示没有明显的生长，划线到营养琼脂（NA）（Fluka）上。将平板在37℃◦温育过夜，将具有最低DS浓度的平板和DS多酚样品在培养过夜后显示无生长，记录为MBC。四环素用作抗生素对照，储备浓度为33mu;g/ ml。
2.7.2 测量H2O2 浓度
通过亚
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