通过梯度醇沉淀将淀粉水解产物分馏成具有低分散性的糊精级分外文翻译资料

 2022-02-14 09:02

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通过梯度醇沉淀将淀粉水解产物分馏成具有低分散性的糊精级分

摘要：建立梯度醇沉淀作为分馏方法，并用于将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉分级成具有较窄分子量分布的糊精级分。添加醇可能导致糊精溶液的某些部分中的醇浓度非常高，这可能妨碍了分馏过程。因此，在分馏过程中应严格控制加醇速率。使用分子量分散度（Dm）作为指标研究醇类型和初始糊精浓度对分馏的影响。通过梯度醇沉淀将母体糊精分级为7个级分，降低Dm，糊精溶液与醇的体积比为4：1,2：1,1：1,1：2,1：3，分别为1：4和1：5。不同醇类的分馏效果较好，为甲醇gt;乙醇gt;异丙醇;而这些醇的糊精产率则相反。此外，各馏分的峰值分子量随着沉淀的醇浓度的增加而趋于降低。最佳初始浓度在1.8％-2.7％的范围内，较低或较高的浓度导致较差的分馏。这些结果表明，梯度醇沉淀是将糊精分级成具有不同摩尔质量的低Dm的级分的有效方法，这将允许糊精级分为特定应用定制。

关键词：分馏梯度 酒精沉淀 糊精分散度

1、介绍

淀粉及其衍生物通常具有宽的分子量分布，这限制了它们的应用。 例如，通常用于临床应用的羟乙基淀粉的摩尔质量范围为40,000-450,000Da[1].具有较高摩尔质量的羟乙基淀粉可引起过敏反应;相反， 具有非常低摩尔质量的羟乙基淀粉可以通过肾脏过快地排泄。因此， 将淀粉水解产物分级成具有较窄分子量分布的糊精级分对于使淀粉及其衍生物的应用多样化是必不可少的。

聚合物的分馏主要通过色谱法，尤其是尺寸排阻色谱法实现[2–5]， 超滤[6–8]和反溶剂沉淀[9–15].自从色谱和超滤的出现以来，这些分馏目标变得不那么耗时。然而，这两种技术成本高，色谱仍然无法生产大规模的分数。相反，当制备大量窄分布聚合物时，反溶剂沉淀似乎呈现出优异的分馏途径。在多种反溶剂沉淀中，醇沉常用于非淀粉多糖的纯化和分馏，如葡聚糖[9,16–19]，菊粉[20,21]，半纤维素[22– 25]和木质素[26,27]，以及其他非淀粉多糖[28–34].这些报告发现， 改变醇的浓度可以将这些多糖沉淀成不同分子大小的部分。另外，醇 沉淀已用于分馏淀粉和淀粉水解产物。1942年，Schoch[35] 通过用1- 丁醇沉淀直链淀粉，从支链淀粉中分离出直链淀粉。随后，一些报道将淀粉分成直链淀粉和支链淀粉 -用Schoch的方法或Schoch的方法稍作修改[36–38].1989年，布雷托夫 特[39] 通过甲醇沉淀分离alpha;-葡萄糖并使用凝胶色谱分析分析的级matography。Defloor等。[40] 发现于1998年，最初的麦芽糖糊精浓度显着影响了乙醇对糊精的分馏。随后，在2003年，Gelders等人[41] 使用醇沉淀来分馏淀粉水解产物得到了具有窄分子量分布的糊精级分，发现分级结果强烈依赖于分馏温度和母体淀粉水解产物的分子量。

然而，上述研究中使用的分馏程序极其多样化且缺乏规律性。因此，据这些研究，对于读者来说建立分离具有不同分子量分布的相同多糖或新多糖的方法是不同的。因此，本研究的目的是建立一种基于使用不 同醇沉淀淀粉水解产物的规律，通过梯度醇沉淀分离淀粉水解产物的方法。在这种情况下，使用梯度醇沉淀的分馏方法可以扩展到其他聚合物。另外，没有使用定量技术来鉴定通过醇沉淀分馏淀粉或糊精的效果。分子量分散度（Dm）可用于指示分子量分布的宽度[42].Dm计算为重均分子量（Mw）与数均分子量（Mn）的比率。Dm的值大于或等于1.较低的Dm表示聚合物的分子量分布较窄，Dm 为表示聚合物是单分散的，例如牛血清白蛋白。因此，本研究选择Dm 作为评估分馏效果的指标。

总之，本研究的目的是建立和探索通过梯度醇沉淀分离淀粉水解产物的方法。具体地，用Dm 作为指标研究了醇加入速率，醇类型和初始糊精浓度对分馏的影响。使用高性能尺寸排阻色谱法与多角度激光光散射检测器和折射率检测器（HPSEC-MALLS-RI）结合测定分子量信息，包括Dm。

  1. 材料和方法

2.1 物料

木薯淀粉购自海南本陆淀粉厂（海南，中国）。甲醇，乙醇，异 丙醇， 1- 丁醇和盐酸购自Sinopharm Chemical Reagent Co.， Ltd（中国上海）。除非另有说明，否则所有其他化学品和试剂均为分析纯。

2.2 通过1-丁醇-HCl水解对木薯淀粉进行糊精化

根据前述方法进行木薯淀粉的1-丁醇-HCl水解[43].将淀粉（25g干基）分散在100mL无水1-丁醇中。通过加入1mL浓缩（36重量％） HCl开始反应，并在不断搅拌下在40℃下进行3天。通过向溶液中加入14mL的1MNaHCO3终止反应，然后将其在冰浴中冷却15分钟并在3500g下再离心5分钟。将沉淀物用50％乙醇洗涤数次，并在35℃的空气烘箱中干燥。最后，将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉粉碎。

2.3 使用不同的醇沉淀1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉

过快速添加醇沉淀淀粉水解产物如下进行。通过搅拌将1-丁醇- HCl-水解的木薯淀粉以2％的浓度溶解在水中在90℃下保持30分钟，冷却至25℃，并以10,000g离心10分钟以除去不溶性部分。将醇（甲醇，乙醇或异丙醇）直接加入糊精溶液中，直至糊精溶液与醇的体积比为2：1,1：1,1：2,1：3,1：4,1：分别为5： 1：6,1：7,1：8,1：9和1:10。将混合物搅拌 30 分钟并在4 ℃ 下保持24 小时。通过在4 ℃ 下离心（10,000g，20分钟）获得沉淀物。此后，将沉淀物干燥并称重以计算糊精产率。通过缓慢加入醇沉淀淀粉水解产物如下进行。通过在90℃下搅拌30分钟将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉溶解在水中，浓度为2％，冷却至25℃，并以10,000g离心10分钟以除去不溶性部分。使用如图所示的装置以0.5mL/min的速率将醇（甲醇，乙醇或异丙醇）加入糊精溶液中。图。1，直到糊精溶液与酒精的体积比为2：1,1：1,1：2,1： 3，分别为1：4,1：5,1：6,1：7,1：8,1：9和1:10。将混合物搅拌30分钟并在4℃下保持24小时。通过在4℃下离心（10,000g，20分钟）获得沉淀物。此后，将沉淀物干燥并称重以计算糊精产率。

2.4 通过梯度醇沉淀分离1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉

通过梯度醇沉淀分馏1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉根据中描述的方法进行图2.具体地，将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉在90℃下搅拌30 分钟，以2％的浓度溶解于水中，冷却至25℃，并以10,000g离心10分钟以除去不溶性部分. .随后，使用如下所示的装置，以0.5mL / min 的速率将醇（甲醇，乙醇或异丙醇）加入到糊精溶液中（连续搅拌）。 图.1，直到糊精溶液与酒精的体积比达到4：1。将混合物再搅拌30 分钟并在4℃下保持24小时。通过在4℃（10,000g，20分钟）离心回 收沉淀的物质，将沉淀物（下文称为F4：1）干燥并压碎。向上清液中进一步加入醇，直至糊精溶液与醇的体积比达到2：1，得到糊精级分F2：1。重复上述步骤，分别得到糊精级分F1：1，F1：2，F1：3， F1：4和F1：5。最后，蒸发上清液以除去水和醇，然后干燥，得到馏分Fgt; 1：5。

图1.用于将醇加入淀粉水解产物溶液中的装置置。

图2.通过梯度醇沉淀进行淀粉水解产物分馏的步骤。

2.5 初始糊精浓度对梯度醇沉淀法分离1-丁醇-HCl水解木薯淀粉的影响

通过在90℃下搅拌30分钟将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉（4g，干基） 溶解在水（100mL）中，冷却至25℃下，以10,000g离心10分钟以除去不溶性部分，得到3.6％糊精溶液。然后将该糊精溶液稀释成2.7％，1.8％和0.9％糊精溶液。然后根章节中所述的程序通过梯度乙醇沉淀分离糊精溶液（0.9％，1.8％，2.7％和3.6％）。

2.6 HPSEC-MALLS-RI分析

数均分子量（Mn），重均分子量（Mw），分子量分散度（Dm）和峰值分子量（Mp）通过HPSEC-MALLS-RI测定样品。将未分级和分级的糊精溶解于流动相（含有0.02％NaN的0.1M NaNO3 溶液3 ）中并持续搅拌。

然后将trin溶液通过0.45lm注射器过滤器过滤，将滤液（0.2mL）注入由HPSEC组成的系统中。等度泵（ 1525 Binary HPLC Pump; Waters ， Milford ， MA， USA）， MALLS检测器（ Dawn DSP; Wyatt Technology， Santa Barbara， CA，USA）和RI检测器（Dawn DSP; Wyatt Technology，Santa Barbara， CA，USA）使用串联连接的Shodex OHpak SB-804和KS-802（Showa Denko America，Inc.，New York，NY，USA）柱并保持在35℃。流动相的流速为0.5mL / min。使用ASTRA软件收集MALLS和RI检测器的电子输出样品的Mn，Mw，Dm, 和Mp

2.7 统计分析

使用ORIGIN 8.0 （ OriginLab Inc. ， Northampton ， MA ， USA）进行统计学分析。数据表示为每个时间段对一个样品的至少三个独立测定的平均值plusmn;标准偏差，并通过单因素方差分析进行分析。统计学显着性建立在P lt;0.05。

结果与讨论

3.1 使用不同的醇沉淀1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉

使用醇以不同速率沉淀糊精时，醇浓度对糊精产率的影 响如下所示图3.通过快速加入醇，糊精溶液与醇的体积比从2：1变为1：4，糊精收率从甲醇的38.4％急剧增加到75.1％，从乙醇的38.1 ％到85.0 ％，以及异丙醇含量为34.5 ％至93.4％。随着酒精浓度的进一步增加，糊精产量略有增加， 最大值为甲醇为79.8％，乙醇为93.6％，异丙醇为96.5％。另一方面，当通过以0.5mL/min的速率加入醇时，糊精溶液与醇的体积比从2：1降至1：4，甲醇的糊精产率从34.9％急剧增加至66.4％，乙醇为32.9％至79.9％，异丙醇为29.0％至87.0％。随着醇浓度的进一步增加，糊精 产率略有增加，甲醇的最大值为72.2％，乙醇的最大值为90.9％，异丙醇的最大值为91.4％。

总之，随着醇浓度的增加，糊精产量增加。另外，由不同醇沉淀的糊精产率按异丙醇gt;乙醇gt;甲醇的顺序，这归因于这些醇的极性为异丙醇lt;乙醇lt;甲醇的顺序。此外，一旦糊精溶液与醇的体积比达到1：5，糊精产率没有显着增加。因此，考虑到糊精产率和成本，当糊精溶液与醇的体积比达到1：5时，停止分馏。另外，当快速加入醇时，糊精产率高于缓慢加入时的糊精产率。这种现象可能是由于快速加入醇导致糊精溶液的某些部分中极高的醇浓度。因此，在通过梯度醇沉淀分馏糊精期间， 应小心控制加醇速率。

3.2 使用不同的醇分馏1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉

通过梯度醇沉淀将1-丁醇-HCl-水解的木薯淀粉分级为七个级分，即F4：1，F2：1，F1：1，F1：2，F1：3，F1：4和F1：5。（由于高水平低分子量糖，Fgt; 1：5是强吸湿性的，并且该部分难以干燥。因此， 无法计算其重量;因此，该馏分不包括在糊精产率中。）由不同醇得到的这些馏分的质量分布示于图4.随着糊精溶液与醇的体积比从4：1 降至1：2，糊精产率显着增加。然而，随着进一步添加醇，糊精产率略微增加并且效率降低。此外，不同醇的总糊精收率的顺序为异丙醇gt; 乙醇gt;甲醇。母糊精的HPSEC-MALLS-RI色谱图和梯度醇沉淀得到的一些代表性馏分显示于图5.MALLS检测器是一种摩尔质量敏感检测器，对

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