抗菌抗氧化电活性注射型水凝胶应用为具有止血性和粘附性且能自愈合的伤口敷料外文翻译资料

 2022-03-22 09:03

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抗菌抗氧化电活性注射型水凝胶应用为具有止血性和粘附性且能自愈合的伤口敷料

摘要：具有抗感染、抗氧化和自愈合等多功能的注射型自我修复水凝胶敷料在伤口愈合中有重大作用，对于它的应用有广大需求并且它的设计是一个很大的挑战。我们开发了一系列以季铵化壳聚糖-g-聚苯胺（QCSP）聚合物为基础的可注射导电自愈凝胶敷料，添加苯甲醛基官能化的聚（乙二醇）-co-聚（癸二酸甘油酯）（PEGS-FA）作为用于皮肤伤口愈合的抗细菌剂，抗氧化剂，增强敷料的电活性。这些水凝胶在自愈性、电活性、清除自由基的能力、抗菌活性、密合性、导电性、溶胀比、和生物相容性这些方面都具有良好的性能。研究表明， PEGS-FA水凝胶的最佳交联剂浓度为15%，并且显示出极好的体内凝血能力，此外还能增强全层皮肤缺损模型中的体内伤口愈合过程，比季铵化壳聚糖/ PEGS-FA水凝胶和商业敷料（Tegaderm TM膜）更有利于VEGF，EGF和TGF-等生长因子的表达，进而增加肉芽组织厚度促进胶原沉积。抗菌电活性注射水凝胶的多功能属性促进了体内伤口愈合的过程，它的自我修复能力延长了使用寿命。这些特性说明了此敷料是一种能治愈的全层皮肤损伤的优秀敷料。

介绍：

皮肤，作为人体最大的组织，可以防止我们身体受到损伤，防止微生物入侵，维持我们的体液/电解质和营养成分[1]。一旦皮肤受到严重，伤口会对人们的生命和健康造成极大威胁，特别是广泛的全层伤口，需要很长的时间才能修复[1-3]，并且，急性和慢性的伤口处理是主要的临床问题之一[1]。因此，非常需要一种敷料能满足伤口快速闭合的需求，促进伤口愈合和减少疤痕的形成。到目前为止，已经开发了包括橡胶，泡沫，电纺纳米纤维，膜和水凝胶等几种类型的伤口敷料[1,4-7]。在这些敷料之中水凝胶敷料可以使伤口保持在一个湿润的环境，吸收组织分泌物，渗透氧气，冷却伤口表面来减缓患者的疼痛[2,8]。此外，注射型水凝胶敷料还展现出许多独特的属性，比如原位封装药物，填充伤口部位（甚至是不规则的空间），粘附伤口等[2,9]。尽管注射型伤口敷料可以填充和粘附伤口来隔离外部环境，但是大多数注射型敷料没有强大的弹性，外部机械力会对它造成一定的损坏和形变，从而会对伤口部位施加压力。这种破坏会缩短水凝胶的寿命，导致感染，进一步诱导炎症反应[10]。具有自我修复能力的自修复材料是生产更安全，更持久的产品的新途径 [11-16]。因此，发明一种具有自我修复能力的注射型水凝胶伤口敷料是很有必要的，但是现在并没有自我修复的注射型水凝胶伤口敷料的报告。

为了防止伤口感染，伤口敷料应该有良好的抗菌性能。特别是抗菌型伤口敷料会使细菌的耐药性越来越严重[17]。研究者们通过在敷料中渗入抗菌剂或者直接使用抗菌活性材料来解决这个问题[6,18-22]。相对于释放抗菌剂的敷料，用抗菌活性材料制成的敷料更有可能呈现持久的抗菌活性，减少对组织的细胞毒性。壳聚糖不仅具有抗菌活性，而且作为水凝胶伤口敷料可以呈现出很多优点，比如镇痛作用、止血活性、具有大量可用于中等交联反应的活性氨基等[23-25]。但是，非酸性环境会限制它的抗菌活性，而且在生理条件下的不溶性会进一步阻碍抗菌水凝胶敷料的原位制备。我们之前工作合成的季铵化壳聚糖-g-聚苯胺共聚物比纯季铵化壳聚糖具有更好的水溶性，抗菌活性和细胞相容性。这些特性都说明了季铵化壳聚糖-g-聚苯胺共聚物是制备抗菌注射水凝胶敷料的优质材料。

人们高度期待一种可以加速伤口愈合的水凝胶伤口敷料。皮肤，由表皮，真皮和角质层组成，由真皮，表皮和角质组成的皮肤是电信号敏感组织之一，不同成分的皮肤其电导率值从2.6 mS/cm到1times;10 -4 mS/cm不等[27,28]。电活性材料已被证明可以促进增强细胞活性，促进成纤维细胞，角质形成细胞，神经，骨骼，肌肉，心脏和间充质干细胞等电兴奋细胞的细胞粘附，增殖，迁移和分化[29-37]。聚苯胺是导电聚合物之一，由于其良好的生物相容性和导电性而得到了广泛的研究[29,31]。由于溶解性较差，聚苯胺的应用并不是很广泛。将聚苯胺接枝在季铵化壳聚糖骨架上可以形成具有良好的电活性和水溶性的导电聚合物[26]。此外，将聚苯胺引入到季铵化壳聚糖中可赋予该物质良好的自由基清除能力。活性氧（ROS）作为病理条件下炎性介质的重要成分，它的过量会干扰细胞的氧化/抗氧化平衡，导致糖尿病患者器官损伤，感染，使组织再生和伤口愈合变得缓慢[39]。我们预计具有电活性和自由基清除能力的水凝胶伤口敷料会有利于伤口愈合。然而还没有具有生物活性的电活性注射型水凝胶的相关报道，所以它的设计会是一个挑战。

在此研究中，我们旨在用季铵化壳聚糖-g-聚苯胺为材料制备具有自我修复能力和粘附性能的抗菌抗氧化电活性注射水凝胶，然后进一步证明其在全层皮肤缺损模型中具有显著促进体内伤口愈合过程的潜力。通过在生理条件下混合季化壳聚糖-g-聚苯胺和苯甲醛基官能化聚乙二醇-co-聚癸二酸甘油酯聚合物溶液，以简便的方法制备可注射水凝胶敷料。系统性的评价水凝胶的化学结构，电化学性能，凝胶时间，形貌，电导率，溶胀率，稳定性和流变性能。水凝胶敷料具有快速自愈能力，有效的凝血能力和良好的粘附性。此外，注射型水凝胶敷料也呈现了良好的抗菌活性、生物相容性和自由基清除能力。此外，我们还在创面闭合，组织病理学检查，生化分析和基因表达等方面进行了体内评估，以研究电活性水凝胶敷料在全层皮肤缺损模型中的治疗效果。

材料和方法

    1. 季铵化壳聚糖-g-聚苯胺的合成（QCSP）

季铵化的壳聚糖-g-聚苯胺（QCSP）是按照我们之前的报道合成的[26]。材料和方法中的细节见图S1。

    1. 苯甲醛官能化的乙二醇和癸二酸甘油酯聚合物的合成

我们按照先前报道的方法[40]，合成了乙二醇和癸二酸甘油酯聚合物。为了合成苯甲醛基官能化的PEGS（PEGS-FA），以EDC作为脱水剂和DMAP作为催化剂将4-甲酰基苯甲酸（FA）通过酯化反应结合在PEGS上（图1b）。材料和方法中的细节见图S1。

    1. 抗菌电活性自修复水凝胶的制备

将质量分数为3.5%的QCSP溶解于PBS（p H = 7.4）中形成具有的恒定浓度的溶液，并且通过加入摩尔质量比为2:1的1M HCl来混合。将质量25%的PEG-FA溶于PBS中以形成具有恒定浓度的溶液。在37℃条件下将这两种溶液混合可以很快地形成水凝胶。我们在3%质量浓度的QCSP溶液中加入0.5%至3%质量浓度以的PEGS-FA合成6种水凝胶。水凝胶的制备细节详见图2a。

    1. 描述

凝胶渗透色谱（GPC），核磁共振（1H NMR），傅里叶变换红外光谱（FTIR），扫描电子显微镜（SEM），紫外可见吸收光谱，循环伏安法（CV），电导率测试，凝胶时间测试和水凝胶稳定性测试用于研究共聚物样品或水凝胶的化学和物理表征。 详细信息请见材料和方法S1中。

    1. 水凝胶的流变属性

使用TA流变仪（DHR-2）通过三种不同的方法测量水凝胶的流变属性。(1) 用时间扫描测试评估水凝胶的储能模量。（2）应变幅度扫描实验获得临界应变。（3）使用交替应变扫描测试来确定水凝胶的自愈能力。详细信息可在S1材料和方法中找到。

    1. 宏观治愈实验

直径为1cm、长度为5.5cm柱状水凝胶（QCSP3 / PEGS-FA1.5）的制备： 首先将水凝胶切成四块，然后将这四块放在一起并置于25℃的保湿器中2小时以使它们自我愈合形成完整的柱状水凝胶。此自愈柱状水凝胶可以支撑自身的重量并弯曲成U形。拍照记录不同情况下的水凝胶。

    1. 水凝胶的粘合强度测试

使用搭接剪切测试来测试水凝胶的体积粘合强度[14]。 详细信息请见S1材料和方法。

    1. 水凝胶的凝血能力测试

根据参考文献的方法[41]，采用出血性肝脏小鼠模型评估了水凝胶的体内止血特性。详细信息请见S1材料和方法。

2.9.水凝胶的溶血活性测试

根据参考文献[26]进行溶血活性测定并且评估水凝胶的血液相容性和细胞毒性。详细信息请见S1材料和方法。

2.10.水凝胶的生物相容性评估

通过使用水凝胶和L929细胞之间的直接接触测试来测量水凝胶的细胞毒性。详细信息请见SI 材料和方法。

2.11.抗菌活性评估

使用大肠杆菌（ATCC 8739）和金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）进行水凝胶表面抗菌活性测试。简而言之，将200mL水凝胶制备于48孔微量培养板上，完全凝胶化后，在48孔培养板中的每个水凝胶表面上加入10ml灭菌PBS中的细菌悬浮液（106CFU mL-1）。将接种后的水凝胶在37℃温育2小时，微孔板内部的相对湿度不小于90%。温育完成后，然后将1mL无菌PBS添加到每个孔中以重新悬浮细菌存活体。使用悬浮在1ml PBS中的10mL的细菌悬浮液（106CFU mL-1）作为阴性对照。 在37℃孵育18至24小时后，对琼脂平板（培养皿）上的菌落进行计数。 每组重复测试三次，计算公式如下：

抑菌率（%）=X100%

2.12. 在全层皮肤缺损模型中的体内伤口愈合

全层皮肤缺损模型用于监测伤口闭合。 动物手术，伤口闭合研究和生化分析的细节请见S1材料和方法。

2.13. 伤口愈合期间的相关基因表达

表皮生长因子（EGF），转化生长因子（TGF-）和血管内皮生长因子（VEGF）是参与创面愈合过程的三种主要生长因子。 收集第5天，第10天和第15天的再生皮肤组织，分别测定三种基因的表达水平。详情见S1材料和方法。

2.14. 组织病理学检查

为了评估皮肤再生和伤口区域的炎症，使用在第5天，第10天和第15天收集的再生皮肤进行组织病理学检查。 详细信息可在S1材料和方法中找到。

2.15.水凝胶的抗氧化能力

通过测量清除稳定的1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基的能力来测试水凝胶的抗氧化剂效力。 详细信息可在S1材料和方法中找到。

2.16.统计分析

使用单向ANOVA分析来自体内伤口闭合实验的数据。使用t检验分析来自研究的实验数据。 P值lt;0.05被认为有统计学意义。 结果以平均值plusmn;标准偏差（SD）表示。

结果和讨论

    1. 具有自修复和粘合性能的抗菌和电活性可注射水凝胶的合成

很多伤口愈合的生化过程非常复杂[42,43]。因此，非常需要一种能够促进伤口愈合的生化过程含多功能特性的敷料。在此项研究中，我们制备了具有抗菌活性，电活性，清除自由基能力，止血活性和粘附性的自愈性等一系列功能的可注射水凝胶敷料，并且可以加速伤口愈合过程。SI是水凝胶的合成示意图，包含水凝胶敷料的合成细节。首先，通过优化残留氨基的含量，溶解度，电导率，抗菌活性和共聚物的细胞毒性等性能来初步合成QCSP（图1a）。将聚苯胺引入到季铵化壳聚糖主链上，降低纯季铵化壳聚糖的细胞毒性，并增强其抗菌活性[26]；其次，通过酯化反应将4-苯甲酰苯甲酸接枝到PEGS羟基封端上，合成了具有良好溶解性、降解性且能够以苯甲醛基团作为交联剂的PEG-FA（图1b）；第三，具有抗菌活性，电活性和抗氧化活性的QCSP通过芳香族Schiff碱反应与PEGS-FA交联，使共聚物混合物凝胶化（图1c和d）。 QCSP / PEGS-FA水凝胶具有柔软而灵活的特性，PEGS-FA灵活的聚合物链和动态化学键合形成的水凝胶网络使其能够承受弯曲和压制（图1e）。此外，由芳香族Schiff碱组成的高度动态的化学键合水凝胶网络也赋予了水凝胶自主自修复性和粘附性。以自修复能力做参考（图S2），设置交联剂浓度梯度为0.5wt％，1.0wt％，1.5wt％至2.0wt％用于进一步研究（图2a）。四种水凝胶分别编码为QCSP3 / PEGS-FA0.5，QCSP3 / PEGS-FA1.0，QCSP3 / PEGS-FA1.5和QCSP3 / PEGS-FA2.0。共聚物名称后的数字表示水凝胶中组分的浓度（wt％）。

用FTIR 傅氏转换红外线光谱分析仪验证了水凝胶的化学结构（图2b）。PEGS-FA中醛基的伸缩振动导致，干燥的QCSP3

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